2021 Fiscal Year Research-status Report
Efficient haploid production using the pseudo-fertilized ovule culture and clarification of the parthenogenesis mechanism in citrus.
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20K06020
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
國武 久登 宮崎大学, 農学部, 教授 (80289628)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | カンキツ / 半数体 / γ線 / 花粉 / 単為生殖 / 偽受精胚珠培養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
カンキツ（Citrus spp.）は栄養繁殖性作物でありヘテロ性が高いことから、諸形質の遺伝様式の解明が難しく、効率的な育種が困難である。半数体は倍加処理によって容易に純系を得られることや、相同ゲノムを1つしか持たないことから遺伝子解析や計画育種のための重要な育種素材となる。カンキツにおける半数体誘導は葯培養や花粉培養による雄核発生の事例があるが限定的である。我々は、花粉への軟X線照射と胚珠培養を組合せることにより半数体を育成した。しかしながら、半数体の個体数は限られており、多数の半数体を獲得し、その発生メカニズムを解明する必要がある。昨年度、一般的に軟X線よりも効果の高いγ線を花粉に照射し、ブンタンの主要品種である‘晩白柚’の偽受精胚珠培養により効率的な半数体誘導について検討した。その結果、培養の4ヶ月以内では半数体を確認することができなかったが、交配40日後では半数性カルスを獲得したこと、軟X線照射花粉の偽受精胚珠培養において交配40日後が最も半数性胚様体を獲得しやすい報告があることなどから、胚珠培養開始時期は交配40日後が適切であると思われた。今年度は、胚珠培養0日～4か月後の胚珠を固定し、パラフィン切片法により、胚のう内部の構造（卵細胞および中央細胞の成熟）の観察を行った。
その結果、ガンマ線照射花粉を受粉させた後の胚珠では、未発達胚珠が多く、60日~80日後の肥大した胚珠でも内部は胚乳のみである割合が高かった。一方で、交配40日後の時点では、発達した胚と胚乳を持つ胚珠の割合は対照区と大きな差は無かった。このことから、胚珠内の胚の発達は、交配40日目までは対照区と同様に進行するが、それ以降に発達停止する割合が増えると推測され、40日を過ぎて発達停止する前に培養を開始すると、本来発達停止する胚のう内の半数性細胞が発達を続ける可能性があると考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交配40日後の時点では全ての胚珠が3 mm以下であり、対照区でも発達した胚を持つ胚珠の数は少なかった。交配60日後、80日後では、3 mm以下の胚珠のうち、既に発達していた胚珠がさらに成長して3 mmより大きい胚珠や完全種子に分類され、3 mm以下の場合は未発達な胚珠である割合が高くなっていると考えられる。胚乳のみを持つ胚珠は、交配40日後では確認できなかったが、交配60日後以降で、3 mmより大きい場合に観察できた。胚乳のみを持つ胚珠では、胚を観察することはできなかったが、交配40日後では未発達であっても必ず胚を観察したため、おそらく退化した胚が存在していると考える。
Murovec・Bohanec（2013）は、ミゾホオズキ属植物の花粉にガンマ線を照射して受粉させたところ、半数体および異数体を獲得したことから、ガンマ線照射花粉による半数体誘導のメカニズムとして、花粉親の染色体異常により雄性側の染色体が脱落し、雌性側の染色体のみで構成される単為発生半数体が誘導されると推測している。本研究において、ガンマ線の照射が花粉稔性や花粉発芽率に影響がなかったことから、おそらく花粉管は胚珠に到達したと考える。パラフィン切片観察を行った3 mm以下の胚珠の全てにおいて、未発達であっても分裂した胚が観察されたことから、花粉管が胚珠に到達したことによる偽受精によって胚発達を始めるが、多くは途中で分裂を停止したために胚珠がそれ以上肥大せず、ガンマ線照射処理区で3 mm以下の未発達胚珠が増加したと考えられる。
以上のように、胚珠内部の胚の発達や停止に関する情報を集めることができた。半数体の獲得数は少ないものの、胚の挙動をつかむことができたことから、予定どおり研究が推移していると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究において、胚珠培養開始時期については、交配40日，60日および80日後に培養を開始し、培養の4ヶ月以内では半数体を確認することができなかったが、交配40日後では半数性カルスを獲得したこと、軟X線照射花粉の偽受精胚珠培養において交配40日後が最も半数性胚様体を獲得しやすい報告があること（Yahataら，2010）などから，胚珠培養開始時期は交配40日後が適切であると思われる。今後は、獲得した半数体のSSR解析による雌性単為発生関連遺伝子の挙動、半数性胚様体の起源を確認するために、Shimizu et al.（2016）の手法によりSSR解析を行う。また、雌性配偶子由来の半数体であることを確認し、単為発生起源であることを立証する。シロイヌナズナに高い相同性をもち、強くDME様遺伝子（Cg6g016280.1）に連鎖するSSRヘテロ型プライマー（TSRP06.2とSSR08B82.1）を選抜しており、その有無について解析する。以上のように、最終年度となる令和4年度は、これらの解析を行うことにより、カンキツ類の単為発生のメカニズムを明らかにする。
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Research Products
(3 results)
