2021 Fiscal Year Research-status Report
サクラ属自家不和合性における新規の花粉側共通因子候補DNaJ-likeの機能解明
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20K06031
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
松本 大生 福井県立大学, 生物資源学部, 准教授 (30632129)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | サクラ属 / 自家不和合性 / DnaJ / S-RNase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、サクラ属のS-RNase依存性自家不和合性における共通因子候補として単離したDNaJ様タンパク質SDJ（仮称）の機能解析を目的としている。2年目にあたる令和3年度は以下の調査を行った。
A. SDJのS-RNase結合領域の調査：前年度は大腸菌発現系で作出したSDJキメラタンパク質を用いて結合領域を調査しようとしたが，そもそも大腸菌発現組換えSDJはS-RNaseと結合しなかった．そこで令和3年度はエピトープタグの位置の異なる組換えSDJ，SDJ姉妹遺伝子産物およびそれらのキメラタンパク質をタバコで発現させて，同様の実験を行った．作出した組換えタンパク質のうち，N末端にmycタグを付加したSDJのみがS-RNaseと結合しているようであった．ただし，その結合親和性は内生SDJと組換えS-RNaseの結合に比べて非常に弱く，本実験系を用いてのS-RNase結合領域の調査は困難であると考えられた．
B. SDJの花粉内相互作用タンパク質の探索： 抗SDJ抗体を固相化したビーズを用いて花粉タンパク質の共免疫沈降を行ったところ，SDJと結合するとみられるタンパク質に由来するバンドが複数得られた．
C. S-RNaseと結合する雌ずいタンパク質の探索：カイコで発現させた組換えS-RNaseを用いて花柱タンパク質の共免疫沈降を試みたものの，S-RNaseと結合する花柱タンパク質候補は見いだせなかった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当年度より福井県立大学に異動して研究室を立ち上げたため実験の着手は遅れたものの，当初計画していた3つの調査を全て実施することができた．ただし，DNaJ様タンパク質のS-RNase結合領域の調査については現在の実験系または結合モデルのもとでは知見を得ることが困難であることも示唆された．この点を踏まえて，研究計画はおおむね順調に進展しているものと判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
下記の2つの調査を実施し，研究の取りまとめを図る．
A. SDJの花粉内相互作用タンパク質の探索：共免疫沈降で得られたSDJ結合花粉タンパク質候補をMS/MSによって同定し，SDJの機能を推定する．SDJ結合花粉タンパク質候補が同定できた場合，SDJ結合花粉タンパク質候補の組換えタンパク質を作出し，SDJとの結合の再現性を調査する．また，SDJ結合花粉タンパク質候補がS-RNaseとSDJの結合に及ぼす影響についても検討する．
B. SDJの不和合反応への関与の検証：アンチセンスオリゴを用いたSDJサイレンシング花粉をS-RNase含有培地で培養し，花粉管伸長に対する影響を調査する．
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| Causes of Carryover |
当年度より福井県立大学に異動して研究室を立ち上げたため，機器の購入計画に変更が生じた．これに伴い，当初予定していたSDJ結合タンパク質候補のMS/MS解析の金額に予算が届かなくなったため，残額が生じた．生じた残額は，次年度予算と合わせてSDJ結合タンパク質候補のMS/MS解析に充てる予定である．
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