2020 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of dopamine receptor signaling which controls feeding behavior of silkworm

Research Project

Project/Area Number	20K06081
Research Institution	Sojo University
Principal Investigator	太田広人崇城大学, 生物生命学部, 准教授 (60450334)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	カイコ / 摂食行動 / ドーパミン受容体 / GPCR / 農薬
Outline of Annual Research Achievements	カイコの摂食行動は、神経系に存在するドーパミン（DA）とその受容体の下流シグナリングによって強く支配されている。これまでに3種類のDA受容体（BmDopR1-3）を単離・同定し、摂食行動との関係性を調べてきた。最近我々は、新たに2種類のDA受容体（BmDopR4, BmEcDopR）遺伝子を見出した。この2種類のDA受容体の機能解析を進めるために、培養細胞での発現、各種アッセイを行った。その結果、BmDopR4は補助因子（G15タンパク質）を一緒に細胞導入することで、微弱ではあるがDAによるCa応答を検出できた。一方、BmEcDopRは同様のCaアッセイや、cAMPアッセイでもDAによる応答は検出されなかった。現在、DA以外の化合物を使って、応答が認められるかを調べている。BmEcDopR遺伝子配列を再検証した結果、BmEcDopRには２種類のアイソフォームが存在することが分かった。この配列の違いが、受容体機能に影響を及ぼしている可能性もあるため、アイソフォームごとの機能比較を進めている。現状、この２種類のDA受容体に対する特異的リガンドの探索は困難なため、これまでの研究で最もカイコの摂食行動に影響していると考えられるBmDopR2に絞り、スクリーニングを進めている。当初の計画では、BmDopR1-3を含めた5種類のDA受容体の組織発現量・局在性の調査も初年度から進める予定であったが、BmDopR1-3のRT-PCR実験にとどまった。いずれの受容体も神経組織に発現していたほか、血球細胞には発現は認められなかった。一部の受容体は、口器の味覚受容器官にも発現していることが分かった。 DA受容体ゲノム編集カイコの作出に向け、カイコ卵に薬液を注入するための装置のセットアップを進めた。現在、卵サイズの違いからくる操作誤差を軽減させるために、顕微鏡ステージの改良を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason BmDopR4の機能解析では、DAによる応答が極めて微弱で、データの再現性を見るのに多くの時間を費やした。BmEcDopRに関しては、各種アッセイ系を駆使してDA応答の検出を試みているが、いまだ結果は得られていない。遺伝子配列を再検証した結果、異なるアイソフォームの存在も認められ、BmEcDopRの機能の特定に遅れが生じている。このような状況から、BmDopR4とBmEcDopRの薬理学的解析、特異的リガンドの探索は、進められなかった。受容体の組織発現量・局在性の調査では、対象としていた器官・組織が微小であったこともあり、精度の高い解剖・サンプリングに時間を要した。
Strategy for Future Research Activity	BmEcDopRに2種類のアイソフォームが存在することは予想外の結果であり、現在、それぞれのアイソフォームについて、受容体機能に違いがあるのかなどを調べている。 BmEcDopR4とBmEcDopRの薬理学的解析や特異的リガンドの探索は、培養細胞でのDA応答が小さすぎる、または応答自体がまだ得られていない理由から、より高感度の新しいアッセイ系を導入し、引き続き実験を進める。現状は、BmDopR2に絞り、カイコの摂食行動を抑制する化合物のスクリーニングを進めることとする。所有しているレポーターアッセイ系による化合物探索だけでなく、共同研究者の協力のもと、計算化学による化合物の絞り込みも検討する。 5種類のDA受容体の組織発現量・局在性の調査も引き続き進めていく。微小な器官・組織を解剖するには、かなりの時間と繊細な技術が求められるため、脂肪体や中腸など、大きな器官・組織での実験を優先的に進める。ゲノム編集では、顕微鏡ステージの改良を進めつつ、まずは摂食行動への影響が最も強いと予想しているBmDopR2に関する実験を進めていく。
Causes of Carryover	カイコのゲノム編集を実施するために、卵に薬液を注入するためのインジェクターやマニピュレーターなどを購入し、それらを実体顕微鏡周辺に取り付ける作業を進めた。このセットアップは概ね完了した。この装置を利用して、予備実験を進めた結果、卵に薬液を注入する際に、操作誤差が大きく出ることが分かり、卵を固定する顕微鏡ステージを改良する必要が出てきた。当初は2020年度内に、装置のセットアップと支払いが完了する予定だったが、新たにステージを購入し、それを取り付けての予備実験を進めることとなった。そのため、ステージの納品と取り付けが完了する2021年度にて、2020年度に発生した費用も合算して、支払うこととなった。コロナの影響もあり、予定していた学会への参加も取りやめた。その結果、計上していた旅費分が余った。