2020 Fiscal Year Research-status Report
Gene edition in endangered endemic fish for the ptoduction of immunodeficient recipient to generate oocytes through trnasplantation
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20K06100
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
高田 達之 立命館大学, 薬学部, 教授 (90206756)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西江 友美 立命館大学, 薬学部, 助教 (30784524)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 琵琶湖固有種 / ホンモロコ / ゲノム編集 / rag2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
琵琶湖の代表的な固有魚種であるホンモロコ (Gnathopogon caerulescence) は近年生息数が激減しており、野生での絶滅の危険性が極めて高いとして絶滅危惧種IA類に分類されている。我々は、生物資源としてのみならず食資源としても重要なホンモロコの保全を目的として研究を遂行してきた。これまでに、受精能を有するin vitro精子分化培養法を確立したが、in vitroでの卵子作製は容易ではない。そこで本研究では他個体への移植による卵子分化を試みるため、ゲノム編集によりDNA組換え酵素rag2の機能を欠損させた免疫寛容個体の作製を試みた。
人工授精したホンモロコ卵にrag2をターゲットとしたgRNAおよびCas9タンパク質をマイクロインジェクションにより導入した。孵化したホンモロコの稚魚（約５ヶ月齢）からゲノムを抽出し、Heteroduplex mobility assay (HMA) により変異の有無、導入効率を検討した。ファウンダー (F0) を人工催熟し、採取した精子を用いてHMAを行い、rag2変異の有無を調べた。さらに個々の精子におけるrag2変異の解析と交配用F0個体を選抜するため、モザイク変異体の凍結精子とゼブラフィッシュ卵子を人工授精し、ハイブリッドを作製した。ハイブリッド稚魚において、ホンモロコrag2のシーケンス解析を行った。
HMAの結果、全ての個体においてrag2 変異を有する精子の存在が示された。ハイブリッド稚魚のrag2変異をシーケンスした結果、rag2機能の欠失した個体が得られる頻度はいずれも30％程度であった。
実際にホンモロコ卵と人工授精し、F1を得た。HMAによりヘテロ個体を選抜し、現在育成中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
モザイク個体の人工催熟により精子採取が可能となった。凍結保存したモザイク個体の精子とゼブラフィッシュ卵子とのハイブリッド作製により、実際の交配前にrag2変位の確認とヘテロ作出効率の良いF0の選抜が可能な手法を開発した。凍結保存したモザイク個体の精子と野生型のホンモロコ卵子との人工授精により数ラインのrag2ヘテロ個体群を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
rag2ヘテロ個体を人工催熟し、精子、卵子を採取し、人工授精により、F2個体を得る。
スクリーニングにより、rag2ホモ個体を選抜する。
室内飼育ホンモロコの人工育成、催熟は容易ではないため、その成体への成長はもとより、性成熟させて精子、特に卵子を得るのが困難であることが予想される。野生ホンモロコの繁殖期は春であるが成長が不十分な場合は春にこだわらず、まず個体の成長を優先させる。一度の人工催熟で性成熟に達しない場合も十分考えられるため、年間を通して人工催熟を繰り返し、F2個体の作製を試みる。野生固有種を用いたrag2ホモ個体の作製はこれまでに例がない。免疫不全のため、感染症などにかかりやすく、育成がさらに困難である可能性が考えられる。その場合は、異なるrag2変異を有する個体の作製、ヘテロ個体を用いた移植実験を検討する。
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| Causes of Carryover |
コロナにより、ホンモロコの繁殖期４、５月に大学入構禁止措置がとられ、繁殖スケールが計画より小さくなったため。
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