2021 Fiscal Year Research-status Report
A possible role of phenylpropanoid metabolism in life cycle of Tricholoma matsutake
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20K06166
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
服部 武文 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 教授 (60212148)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉住 真理子 徳島県立農林水産総合技術支援センター(試験研究部), 徳島県立農林水産総合技術支援センター(資源環境研究課), 研究員(専門・係長) (40822846)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ケイ皮酸メチル / LC-MS/MS / Tricholoma matsutake / methyl transferase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、マツタケにおいて、ケイ皮酸→ケイ皮酸メチル過程を触媒する酵素を特定し、同過程を遺伝子レベルで明らかにすることである。2021年度（令和3年度）は、ケイ皮酸→ケイ皮酸メチル活性を示すタンパク質をコードするcDNAをマツタケよりクローニングした。植物のバジル(Ocimum basilicum ) (Kapteyn et al., 2007)、コケ類 (Conocephalum salebrosum) (Zhang et al., 2019)で明らかにされた、ケイ皮酸→ケイ皮酸メチルを触媒するcinnamate carboxyl methyltransferaseをクエリーとし、マツタケ培養菌糸のRNA-seqデーターベースに対しtblastn検索したが、信頼性の高いホモログは見出せなかった。そこで、 S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferaseをコードするとアノテーションされた配列の中からいくつかの遺伝子を選抜し、そのcDNAを発現させた大腸菌のある物が、ケイ皮酸のメチル化活性を示した。さらに、当該大腸菌から部分精製した組換え酵素を用いた酵素反応では、加熱失活組換え酵素を用いたnegative controlの5.8倍のケイ皮酸のメチル化活性が得られた。さらに、本部分精製組換え酵素を用いた反応で生成したケイ皮酸メチル生成量は、用いた酵素量に比例して増大した。この結果は、部分精製酵素はケイ皮酸のメチル化活性を有することを示している。現在、純度の高い組換え酵素の精製法の確立と、酵素の特性解明を進めている。
さらに、2022年度（令和4年度）自然界で当該遺伝子の発現が観察されるか検討する、マツタケシロ候補地を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度（令和3年度）に検討する当初計画は、１．マツタケ菌糸より、ケイ皮酸→ケイ皮酸メチル活性を有する酵素をコードするcDNAをクローニングする。２．同酵素の特性を解明する。３．自然界でのマツタケシロ候補地を見出す、ことであった。まず、１．については、当該cDNAをクローニングすることができ、当初の計画を達成した。２．については、まず、発現された組換え酵素の大部分はinclusion bodyとして組換え大腸菌に存在し、可溶化画分に十分な量得る事が出来なかった。その為、クローニングされたcDNAの真偽は、少量可溶性画分に得られた組換え酵素を、部分的に精製し、それを用いた酵素反応を行うことを、数回繰り返し明らかにする方法で明らかにした。その為、精製酵素を用いて行う、特性解明は完遂していない。しかしながら、特性解明に必要な酵素量は、組換え大腸菌の大量培養で得る事ができ、新たな技術を開発する必要が無いと十分考えられる。
３．については、2022年度（令和4年度）自然界で当該遺伝子の発現が観察されるか検討する、マツタケシロ候補地を見出すことが出来た。一般的に、自然界での生息地（マツタケのシロ）を特定することは、年に2回程度しか自然界でマツタケは発生しないため難しい。しかし、つぶさに山野をめぐっておられる研究協力者の働きにより、候補地を見出すことが出来たのは、研究遂行に意義がある。
以上の結果、概ね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
以下、１，２を推進し、研究総括する。１．マツタケからクローニングされたcDNAがコードするケイ皮酸→ケイ皮酸メチルを触媒するS-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferaseの特性解明。２．自然界のマツタケシロにおける同遺伝子の発現状況の解明。１．に関しては、まず、多量の組換え大腸菌を調製し、より多量の組換え粗酵素を得、SDS-PAGEにて単一のバンドを示すまで、アフィニティークロマトグラフィーの精製条件を検討する。適宜、他のクロマトグラフィーを用いた酵素精製方法も組み合わせる。精製酵素を用いて、速度論的定数(Km, kcat), 基質特異性、至適pH、反応温度を中心に明らかにする。具体的には、精製酵素を用いてS-adenosyl-L-methionine, ケイ皮酸および類縁化合物を基質として酵素反応を行う。反応後内部標準として[2, 3, 4, 5, 6-2H5]ケイ皮酸メチルを添加し、生成物である非標識のケイ皮酸メチルと共に酢酸エチル抽出する。得られた、生成物、内部標準をLC-MS/MSのMRM分析に供し、各生成物のイオン量を、別途作成した検量線に照らし合わせ、生成したケイ皮酸メチルを定量し、活性を明らかにする。
２．に関しては、2021年度（令和3年度）に見出した、マツタケシロ候補地より、シロ菌糸、マツタケ子実体を得、RNAを抽出し、明らかにされた遺伝子の発現量を比較する。
上記1，2の結果を基に、当該遺伝子がコードするタンパク質の、マツタケ生活環における意義に関し、総括する。
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| Causes of Carryover |
当初予定では、2021年度（令和3年度）はクローニングされたcDNAがコードする酵素の特性解明まで進める予定であった。しかし、現在までの進捗状況で記載した通り、特性解明に用いることが出来るにたる可溶性組換え酵素量を、比較的容易に多量に得る事ができなかった。その結果、酵素特性解明に使用する試薬費用を2021年度（令和3年度）では使わなかった。そのお金を、2022年度（令和4年度）組換え酵素の特性解明に使用する予定である。
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