2021 Fiscal Year Research-status Report
Functional analysis of microRNA in morphological changes of termites and use of breeding insects as cultivation feed
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20K06171
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
板倉 修司 近畿大学, 農学部, 教授 (60257988)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | マイクロRNA / インヒビター / 変態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヤマトシロアリ職蟻ならびにイエシロアリ職蟻とニンフに、miR-7インヒビター（5'-AC CAG UAC CUG AUG UAA UAC UCA-3'）、miR-8インヒビター（5'-AC AAC AAA AUC ACU AGU CUU CCA-3'）、miR-12インヒビター（5'-GA CAU CUU UAC CUG ACA GUA UUA-3'）とNuclease free waterを注入した。可溶性タンパク質と膜タンパク質の二次元電点電気泳動を行い、MALDI-TOF/MS解析を実施した。
また、ヤマトシロアリでは定量RT-PCRを、イエシロアリではIllumina systemによるRNA-Seq解析を行い、転写発現解析を実施した。
MALDI-TOF/MSで分析しMascot検索を行った結果、ヤマトシロアリでは、myosin heavy chain、paramyosin、ATP synthase subunit beta、ATP synthase subunit beta、actin、β-actin、voltage-dependent anion-selective channel-like、hexamerin I、enolase、β-ureidopropionase、glutatione S-transferase 1が同定され、さらにmiR-8と12インヒビター注入でmyosin heavy chain、paramyosin、voltage-dependent anion-selective channel-likeの発現量が増加した。イエシロアリでは、 myosin heavy chain、actin、hexamerinが同定された。
ヤマトシロアリ職蟻の定量RT-PCRでは、miR-7、12インヒビター注入でnostrin、ribosomal proteinなどの発現量が増加していた。イエシロアリのRNA-Seq解析では、miR-7、8、12インヒビター注入でbroad-complex core protein、nuclear hormone receptor FTZ-F1、juvenile hormone epoxidase (cytochrome P450 15A1)、juvenile hormone binding protein（2遺伝子）、juvenile hormone-inducible protein、ecdysone receptor（2遺伝子）、ecdysone receptor EcR/USP、vitellogenin、oocyte zinc finger protein（3遺伝子）、methoprene-tolerantのmRNA発現量が増加していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
イエシロアリ職蟻とニンフ、ならびにヤマトシロアリ職蟻へのマイクロRNAインヒビター注入により発現量が増加するmRNAとタンパク質の解析は順調に進んだが、ヤマトシロアリのニンフを今年度も採集できなかったため、インヒビター注入によりニンフで誘導されるmRNAとタンパク質の解析を実施することができなかった。これまで使用してきた和歌山県採集コロニーの他に、宮崎県や鹿児島県でヤマトシロアリを採集し、ニンフを採集しようとしたが、実験期間中にニンフが出現することはなかった。
概要に記載したイエシロアリでの幼若ホルモン（juvenile hormone）とエクダイソンに関連するmRNAの増加は、職蟻ではなくニンフで顕著であった。これらの遺伝子は、階級分化で重要な働きをすると考えられるため、ヤマトシロアリでも職擬だけでなくニンフへもマイクロRNAインヒビター注入実験を実施することが、生殖階級を誘導するためには重要である。
また、マイクロRNAインヒビター注入により、発現量が増加するmRNAとタンパク質が明らかになってきたが、幼形生殖虫や有翅虫への分化を促進するレベルに達っしていない。これまでの研究で、miR-7、8、12がjuvenile hormone epoxidaseやjuvenile hormone binding protein、ecdyson receptorなどの発現制御に関与する可能性が示されたので、次年度はマイクロRNA mimicを注入し、juvenile hormone合成の最終ステップに関与するjuvenile hormone epoxidaseの発現量を人為的に抑制することで、生殖能力を有する階級への分化促進を試みる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
イエシロアリへのマイクロRNAインヒビター注入により、エクダイソン応答遺伝子broad-complex core protein（2遺伝子）とエクダイソンパルス後に誘導される転写因子nuclear hormone receptor FTZ-F1遺伝子、また幼若ホルモン合成に関連するjuvenile hormone epoxidase (cytochrome P450 15A1)遺伝子と幼若ホルモン運搬に関与するjuvenile hormone binding protein（2遺伝子）、幼若ホルモンに誘導されるjuvenile hormone-inducible protein遺伝子、卵形成に必要なecdysone receptor（2遺伝子）とecdysone receptor EcR/USP遺伝子、卵黄タンパク質前駆体vitellogenin遺伝子、卵母細胞成熟で機能するoocyte zinc finger protein（3遺伝子）、卵黄形成と卵母細胞成熟で機能するmethoprene-tolerant遺伝子のmRNA発現量の増加がみられた。これらのマイクロRNAインヒビター注入によるRNA発現量の増加は、ニンフで顕著であった。
これらの中で、juvenile hormone epoxidase (cytochrome P450 15A1)はjuvenile hormone合成の最終ステップで機能する酵素であり、その発現量を抑制することでjuvenile hormone合成を阻害できると予測される。
マイクロRNA mimicを注入し、juvenile hormone epoxidase (cytochrome P450 15A1)の発現を人為的に抑制することでシロアリ体内のjuvenile hormone量を低下させ、生殖能力を有する階級への分化促進を試みる予定である。
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