2020 Fiscal Year Research-status Report

光合成細菌がクルマエビの自然免疫を活性化するメカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	20K06216
Research Institution	Sojo University
Principal Investigator	宮坂均崇城大学, 生物生命学部, 教授 (60451283)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	クルマエビ / 光合成細菌 / プロバイオティクス / 自然免疫 / 遺伝子発現 / 定量RT-PCR / 水産養殖
Outline of Annual Research Achievements	海産性光合成細菌Rhodovulum sp. KKMI01はクルマエビの飼育水に1×10^3菌/ml（菌培養液の100万倍希釈）という極めて低濃度で添加することで、エビの成長を促進し、自然免疫系遺伝子を活性化することが判っている。 Rhodovulum sp. KKMI01が持つクルマエビの自然免疫を活性化する物質を細胞壁成分のlipopolysaccharide（LPS）と予想して以下の実験を行った。Rhodovulum sp. KKMI01からLPSを精製し、クルマエビ飼育水への投与試験を行った。LPSの投与濃度は、1pg/ml、100pg/ml 、10ng/mlの3条件として飼育水に直接添加した。クルマエビは体重約4gのものを熊本県牛深市のクルマエビ養殖場から入手して用い、各投与区３尾を用いて試験を行った。試験開始3日後、頭と尻尾を除いたクルマエビ全体からtotal RNAを分離した。分離したRNAを鋳型にcDNAを合成し、定量RT-PCRで以下の自然免疫に関わるタンパク質をコードする遺伝子の発現量を定量した。NADPH oxidase, Prophenoloxidase, Lysozyme, Caspase, Crustin-like peptide, C-type lectin3, Serin proteinase inhibitor, Toll-like receptor 2, Immune deficiency (IMD)。その結果、NADPH oxidase, Prophenoloxidase, Lysozyme, Caspase, Crustin-like peptide, C-type lectin3, Serin proteinase inhibitorでLPS投与により発現が上昇する傾向が認められ、当初の予想どおり、海産性光合成細菌Rhodovulum sp. KKMI01が持つクルマエビの自然免疫を活性化する物質が細胞壁成分のLPSである可能性が示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初予想していたとおり海産性光合成細菌Rhodovulum sp. KKMI01が持つクルマエビの自然免疫を活性化する物質の一つが細胞壁成分lipopolysaccharide（LPS）である可能性を飼育水への投与実験で示すことができた。なお、菌そのものが効果を示す投与濃度は、菌濃度 1×10^3菌/mlであり、これは菌の乾燥重量濃度では5ng/mlとなる。菌乾燥重量に対するLPSの含有量は文献値では5％から10％であるため、菌体5ng/mlはLPSでは0.2ng (200pg)/mlから0.4ng(400pg)/mlと計算される。今回の実験で設定したLPS濃度は1pg/ml、100pg/ml 、10ng/mlで、この濃度範囲で自然免疫系の遺伝子が活性化されたこともLPSが有効成分であることを示している。
Strategy for Future Research Activity	これまでの検討で、海産性光合成細菌Rhodovulum sp. KKMI01が持つクルマエビの自然免疫を活性化する物質の一つが細胞壁成分lipopolysaccharide（LPS）である可能性が示された。今後は、まず試験区の個体数を増やして実験を繰り返し、LPSの効果を統計的に有意差があるデータで示す。さらに、淡水性光合成細菌や、他のグラム陰性菌（大腸菌、サルモネラ菌、）のLPSの自然免疫活性化効果を海産性光合成細菌Rhodovulum sp. KKMI01のLPSと比較を行う。具体的には、Rhodovulum sp. KKMI01のLPSが効果を示した100pg/ml程度の濃度で様々な菌のLPSをクルマエビ飼育水に投与し、自然免疫系遺伝子の活性化の比較を行う。これにより、Rhodovulum sp. KKMI01のLPSの効果が同株に特異的なものか、あるいは、他の菌株でも同様の効果があるのかを明らかにする。
Causes of Carryover	コロナ禍の影響で、学会がOnline開催となり、予定していた旅費100,000円の支出が0円になった。また－８０度フリーザーの予算を1,800,000円で計上していたが、実際には予定より多い値引き額を得ることができ、支出が減少した。翌年度分として請求した助成金は、次年度研究計画に検討項目として追加した淡水性光合成細菌LPS試験の費用（菌からLPSを抽出するキット費用等）に充当する。