2020 Fiscal Year Research-status Report
Analyses of shellfish hematopoiesis using single-cell RNA-Seq and genetic engineering technology
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20K06222
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
長澤 一衛 東北大学, 農学研究科, 助教 (50794236)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横井 勇人 東北大学, 農学研究科, 助教 (40569729)
尾定 誠 東北大学, 農学研究科, 教授 (30177208)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 貝類 / 造血機構 / 幹細胞 / シングルセル解析 / 遺伝子改変 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では研究期間内において以下の３課題の達成を目指している。課題A.シングルセル解析による貝類の血球分類とマーカー遺伝子の単離、課題B.貝類の細胞で外来遺伝子を安定発現させるシステムの開発、課題C.GFP遺伝子の導入による貝類血球の可視化である。2020年度は課題A、Bに対して研究を遂行し下記の成果を得た。課題Aではホタテガイ血球のシングルセル遺伝子発現解析を実施し、約5000細胞の各血球における遺伝子発現プロファイルを取得した。得られたすべてのホタテガイ血球の遺伝子発現プロファイルをt-SNE解析により可視化したところ、10種類の細胞集団に分離されることを確認した。課題Bでは種々の二枚貝類種に対してエレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法の開発を試みた。エレクトロポレーション法の開発では、ホタテガイの各器官を用いた初代培養細胞を作製し、これらに対してエレクトロポレーションにおける電気条件を検討することで比較的高い生残率を維持できる電気条件を見出した。一方マイクロインジェクション法の開発では、マガキ、ムラサキイガイ、ホタテガイの成貝から人工授精を介して得られた受精卵に対しマイクロインジェクションを実施した。マイクロマニュピレーターと倒立顕微鏡を用い、色素で着色した各種溶液を受精卵の細胞質内へ導入することが可能となった。これまでにGFP遺伝子をコードする合成RNAおよびDNA発現ベクターを導入したが、これまでのところレポーター遺伝子の発現は得られていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題Aでは、強い凝集活性を示すホタテガイ血球を生かしたまま単一細胞の状態で維持する方法を開発したことで、今回初めてホタテガイ血球におけるシングルセル遺伝子発現解析に成功した。課題Bでは、外来遺伝子を発現させる遺伝子導入技法の確立には至っていないものの、二枚貝類における初代培養細胞の調整方法、受精卵の獲得方法など多くの基礎的な知見を蓄積することができている。以上、これまでの本研究の課題の遂行状況と成果から、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度以降は、課題Aにおいて同定した10種類の血球細胞の各集団に対して遺伝子発現の内訳を解析することで、各血球集団の形質の推定やマーカー遺伝子等を明らかにする予定である。また課題Bでは、魚類や哺乳類等で利用できる発現ベクターが、二枚貝の細胞では利用できないことが示唆された。そのため現在、二枚貝類における種々の内在性プロモーターの活性を検証し、二枚貝類で安定的に機能する発現ベクターの開発を実施中である。さらに課題Cでは、CRISPR-Cas9システムを二枚貝に適用することでレポーター遺伝子のノックイン技法の開発に着手する。
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| Causes of Carryover |
2020年度は課題B.外来遺伝子を発現させる遺伝子導入技法の確立において、種々の発現ベクターを構築する実験に遅れが生じ、十分な実験の遂行ができなかったため次年度使用額が生じた。これについては2021年度における最重要課題として早期に実施する。同時に翌年度分として請求した助成金を使用した研究課題についても2021年度内の遂行に努める。
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