2021 Fiscal Year Research-status Report
微細藻類におけるプログラム細胞死の分子機構解明と物質生産制御への応用
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20K06237
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
辻 敬典 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (40728268)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | プログラム細胞死 / タンパク質リン酸化酵素 / 硫黄欠乏応答 / トリアシルグリセロール（TAG）蓄積 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は緑藻クラミドモナスを用い、主に以下の二つの研究を進めた。
１）細胞死を制御するタンパク質リン酸化酵素TAG accumulation regulator 1 (TAR1)の機能の見直し
先行研究において、TAR1が独立栄養条件・窒素欠乏下でトリアシルグリセロール（TAG）の蓄積を抑制し、かつ細胞死を促進する因子であることが報告された。しかし、先行研究で単離された変異体（tar1-1）の親株であるC9-3株は、窒素欠乏下でのクロロフィルの減少（白化）が著しく速い異常株であることが明らかになったため、改めて別の親株から作出したtar1変異体の解析を進めた。そして、tar1変異体の表現型として、先行研究で明らかにされた白化の抑制やTAG高蓄積のほか、独立栄養条件下で窒素欠乏移行後の細胞の分裂が抑制されていることを見出した。
２）新奇コイルドコイルドメイン含有タンパク質（CCDC）と細胞死の関連
窒素あるいは硫黄の欠乏応答に異常が見られた変異体の単離を進め、機能未知のコイルドコイルドメイン含有タンパク質（CCDC）が、硫黄欠乏下での細胞死を促進する因子であることを示唆するデータを得た。またCCDCがリン酸化されていることを明らかにし、リン酸化カスケードを介した細胞死の制御機構の可能性について検討した。さらに、CCDCによる細胞死の制御機構を調べるため野生株との比較RNA-seq解析を行い、発現変動遺伝子にプログラム細胞死制御因子と推定される遺伝子が複数含まれていることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、藻類におけるプログラム細胞死制御因子の同定と、同定した因子の変異体の作出によるTAG蓄積の制御の二つを目指している。これまでに、タンパク質リン酸化酵素TAR1が、独立栄養条件・窒素欠乏下でのTAG蓄積およびクロロフィル減少（白化）と細胞死を抑制することを確認した。これらの表現型は先行研究でも報告されているが、先行研究では異常な株（C9-3）を親株として用いていたためその妥当性に疑問が持たれていた。しかし、本研究により別の野生株（C9-1およびCC-125）から作出したtar1変異体の解析を進めることで、tar1変異体における白化と細胞死の抑制は、特異な親株に依存したものではないことを明らかにした。
また、新奇コイルドコイルドメイン含有タンパク質（CCDC）を欠損した変異体において、硫黄欠乏下で細胞の崩壊が野生株よりも遅れ、硫黄欠乏4日目の培養液あたりのTAG量が野生株の1.8倍に増加することを明らかにした。これは、新規因子の同定とそのエンジニアリングによるTAG蓄積制御という本研究の目的を達成するうえで大きな進歩であった。Phos-tag電気泳動解析により、CCDCがリン酸化されていることを明らかにし、現在はCCDCのリン酸化状態が細胞死の制御に関連するかを解明するため、硫黄欠乏に応答したリン酸化状態の変化について研究を進めている。
以上のように、新規細胞死制御因子の同定と、その改変によるTAG蓄積の制御についての研究は、研究は順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
タンパク質リン酸化酵素TAR1の解析については、窒素欠乏下で細胞死を抑制することを示すデータは得ているが、細胞死の評価にエバンスブルー染色法を用いているため、プログラム細胞死か否かという点については結論が出ていない。そのため、tar1変異体と野生株において、プログラム細胞死の指標とされる、（1）DNAのヌクレオソーム単位での切断（ラダー化）、（2）細胞膜ホスファチジルセリンの反転、（3）カスパーゼ活性、の3点について野生株と変異体で定量的に比較し、TAR1がプログラム細胞死を制御するかを明らかにする。CCDC変異体についても、コールターカウンターによる粒子径分布から細胞崩壊が抑制されると推定しているに過ぎないため、上記のプログラム細胞死の指標については調べていない。そのため、ccdc変異体においてもtar1変異体と同様に、プログラム細胞死の定量的評価を行う。
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| Causes of Carryover |
複数の変異体について同時並行で解析を進めていたが、コロナ禍の影響もあり、当初の予定より表現型の決定や相補株の作成などに時間を要した。そのため、tar1変異体やccdc変異体におけるプログラム細胞死の生化学的指標の測定ができず、次年度へと実験の一部を遅らせることとした。今年度購入する予定だったプログラム細胞死検出キット（アネキシンV染色キットやカスパーゼ活性測定キット）については、次年度に購入し実験を行うことにした。
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