2021 Fiscal Year Research-status Report
Identification and functional characterization of eel serum toxin
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20K06242
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
塚田 岳大 東邦大学, 理学部, 准教授 (50596210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
後藤 勝 東邦大学, 理学部, 准教授 (80379289)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ニホンウナギ / 血清毒 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ウナギの血清毒は、タンパク性で熱に弱く、摂取や接触により下痢、嘔吐、皮膚炎などの症状を引き起こすことが古くから知られているが、毒の本体（遺伝子）はまだわかっていない。本研究の目的は、ニホンウナギの「血清毒」の遺伝子とそのタンパク質構造を同定することである。研究代表者らは、令和2年度（初年度）の研究でウナギ血清毒の候補遺伝子の全長クローニング、組織発現解析、in situ hybridizationを行い、ウナギ血清毒が肝臓で作られ、血清に分泌される115 kDaの血清タンパク質であることが示唆された。令和3年度は、結晶構造解析や毒性解析に必要な血清毒の精製を行った。まずは、クローニングした全長配列を、大腸菌用発現ベクター(pET30aベクター)に組み込み、リコンビナントタンパクの精製を試みた。しかし、大腸菌の発現効率が低く、結晶構造解析や毒性解析に十分な量のリコンビナントタンパク質を得ることができなかった。そこで、ウナギ血清からの血清毒単離を試みた。硫安分画、イオン交換カラム精製により、10 mLのウナギ血清から5 mgの血清毒を精製することに成功した。また、精製したウナギ血清毒を用いて質量分析を行ったところ、肝臓からクローニングしたウナギ血清毒の配列と同じであることがわかった。令和3年度の研究により、ウナギの血清からウナギ血清毒を単離する手法が確立され、肝臓で発現しているウナギ毒遺伝子が、血液中に分泌されていることを証明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和3年度（2年目）は、シグナルペプチド配列を除いたウナギ血清毒遺伝子をpET30aベクターに組み込み、大腸菌によるリコンビナントタンパクの発現と精製を試みた。小規模スケールでのリコンビナント発現系までは確立できたが、リコンビナントタンパク質が不安定なためHisタグを用いた精製では、分解産物が多く、結晶構造解析や毒性解析に必要な高純度・高濃度の血清毒を単離することができなかった。そこで、ウナギ血清から血清毒を単離することを試みた。硫安分画、イオン交換カラム精製により、10 mLのウナギ血清から5 mgの血清毒を精製することに成功した。初回の精製では、数週間でタンパク分解が起きたが、タンパク分解阻害剤やEDTAを入れることにより、ウナギ血清毒が数ヶ月以上安定して保存できることを確認した。また、質量分析により、精製したウナギ血清毒の配列が、肝臓からクローニングしたウナギ血清毒の配列と同じであることがわかった。さらに、さまざまな魚種のゲノムデータベースからウナギ血清毒と相同な遺伝子を探索し、系統樹解析を行った。その結果、硬骨魚類の一部の種で保存されているタンパク質であることがわかった。リコンビナントタンパクの計画は、現在、別の発現ベクターに入れたり、タンパク分解阻害剤を入れるなどの条件検討をしている。概ね計画通り進んでおり、実験計画の変更はない。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在行っている小規模ウナギ血清毒の精製が終了したのち、大規模精製を試みる。大量のリコンビナントウナギ血清毒が精製できた時点で、X線回折実験の条件検討を行う。すなわち、スクリーニングキットを用いた結晶化条件の検索と結晶化条件の最適化である。これらは１日50条件の結晶化を基本とし、１年間でおよそ１万条件を予定している。結晶化が進まない場合は、血清毒の精製法の再検討、安定化剤を用いた条件検討、近縁種からのサンプル調製を予定している。また、血清毒タンパクの分子量が大きいため、ドメイン毎に分けてサンプルを調製・結晶化することも想定している。結晶化条件が決まり次第、X線回折強度データ測定を行い、重原子多重同型置換法などの手法により位相問題を解決した後、立体構造の構築および精密化の過程を経て立体構造を決定する。一方で、精製した血清毒を用いて生物毒性評価を行う。精製タンパクをマウス静脈および経口投与し、ウナギ血清毒の致死量（LD50）を調べる。また、ウナギ血清毒がウナギの被食者および捕食者に強い毒性を示すか調べるため、甲殻類や水生昆虫（被食者）および海産大型魚類（上位捕食者）を用いた毒性評価も行う。さらに、中和実験、免疫染色、Western blottingに用いる抗体も作成する。
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Research Products
(1 results)
