2021 Fiscal Year Research-status Report

シガトキシン同族体（CTXs）による電位依存性Na+チャネル阻害の分子機構解明

Research Project

Project/Area Number	20K06246
Research Institution	Fisheries Research and Education Agency
Principal Investigator	池原強国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産大学校, 教授 (90359951)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	シガトキシン / 電位依存性Na⁺チャネル / リコンビナントタンパク
Outline of Annual Research Achievements	シガトキシン（CTX）やブレベトキシン（BTX）等多くの海洋自然毒は、電位依存性Na+チャネル（Navch）を分子標的とし、CTXやBTXがNavchの特定の部位（site-5と呼ばれるポアドメイン領域）に結合することでチャネル機能が阻害されると推定されてきた。しかし、この仮説提唱後に単離されたBTXB2、B3、B4やCTX類あるいは化学誘導体の構造と生物活性は仮説に合致せず、CTXやBTXが結合すると想定されるsite-5の位置や結合様式の詳細は明らかにされていない。そこで、本研究ではリコンビナントNavch（rNavch）と蛍光標識したBTXを用いたin vitro Navch競合結合試験系を構築し、構造の異なる各種CTX同族体によるNavchへの結合を測定することによってNavchを標的とする海洋自然毒の結合特性や結合部位を解明するための研究基盤を構築することを目的とした。令和3年度は、試験系構築に必要なリコンビナント細菌Navch（rNavchRp）の大量調製及び蛍光色素BODIPYによる蛍光標識BTXの調製を継続し、in vitro 競合結合試験系構築のための条件検討に必要な量を確保した。また、BODIPY蛍光シグナルをイメージアナライザーで定量する系を構築し、これら精製物を用いたin vitro 競合結合試験系構築の条件検討を行った。今後は、rNavchRpへのBTXの特異的結合を示し、競合結合試験系構築を目指す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和3年度は、in vitro 競合結合試験系構築のための条件検討に必要なrNavchRp及びBODIPY標識PbTx2をそれぞれ、約0.6mg、約5μg確保した。これら精製物（rNavchRpとBODIPY標識PbTx2）を用いて、グラスファイバーフィルターマイクロプレート（マルチスクリーン）によるin vitro 結合試験を実施した。その結果、BODIPY標識PbTx2のグラスファイバーフィルターへの吸着及びrNavchRp添加によるフィルター透過を観察した。これらの結果は、rNavchRpとBODIPY標識PbTx2の相互作用を示唆するものと考えられる。これらの成果から、in vitro 競合結合試験系構築のための条件検討として進捗状況はおおむね順調に進展していると評価した。
Strategy for Future Research Activity	令和3年度の成果として、rNavchRpとBODIPY標識PbTx2の相互作用を示唆する結果が得られたことから、令和４年度は、これら相互作用の特異性について解析を行い、rNavchRpとBODIPY標識PbTx2の結合に対するCTX類との競合阻害について検討を進める。