2021 Fiscal Year Research-status Report

ゲノム編集による効率的なワクチン製造のための培養細胞株樹立の試み

Research Project

Project/Area Number	20K06248
Research Institution	Fisheries Research and Education Agency
Principal Investigator	河東康彦国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(南勢), 主任研究員 (90634220)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	ゲノム編集 / ワクチン / ウイルス / CRISPR-Cas9
Outline of Annual Research Achievements	魚類のウイルス病対策ではワクチネーションがその主体となっているが、ワクチン単価が高いことからワクチン接種が普及せずに被害が拡大している状況が散見される。マダイイリドウイルス病のワクチンは、魚類培養細胞で産生した病原体をホルマリンで不活化したものであるが、ウイルス産生効率が低いため製造コストの上昇につながっている。一方、申請者が実施した先行研究では、培養細胞における何らかの因子によりウイルス複製が阻害されていることが示唆されている。そこで本研究では、培養細胞におけるウイルス複製阻害因子を網羅的な遺伝子発現解析により推定し、その情報を元にゲノム編集技術を利用してウイルス複製阻害因子をノックアウトした細胞株の樹立を試みる。昨年度はマダイイリドウイルスの培養に用いるイシガキダイ由来細胞（SKF-9）について、ウイルスが増えやすい継代数28の細胞株およびウイルス産生量が低下した継代数103の細胞株を用いて、ウイルス感染細胞のRNA-seqによる網羅的なトランスクリプトーム解析を実施した。その結果、ウイルス産生量が低下していた継代数103の細胞では、PI3K-Akt signaling pathwayや免疫応答に関わるChemokine signaling pathwayにおける複数の遺伝子群がウイルス複製の阻害に関与している可能性が示唆された。本研究課題では、異なる遺伝子を個別にノックアウトした細胞株を複数株樹立して、ウイルス産生量の変化を比較する必要があることから、今年度は効率的にゲノム編集およびノックアウト細胞のスクリーニングが可能な試験系の構築に注力した。その結果、ホモロジーアームを必要としない1種類のドナーベクターを構築すれば、あとはオリゴDNAの設計のみで様々な種類の遺伝子に対するゲノム編集が実施できる試験系を構築した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ゲノム編集した細胞のスクリーニングでは、マーカー遺伝子を挿入するためにノックアウトしたい標的遺伝子ごとにホモロジーアームを組み込んだドナーベクターをクローニングする必要がある。そこで、本研究では2種類のsgRNA でDNA を切断し、2種類のオリゴDNA でプラスミドDNAをノックインする方法（2 ヒット2 オリゴ法：2H2OP 法）を採用した。この方法を用いることにより、1種類のドナーベクターを構築すれば、オリゴDNAの設計のみで様々な種類の遺伝子に対するゲノム編集に対応できる。まずは、抗生物質耐性遺伝子および蛍光遺伝子を搭載したプラスミドに、CRISPR-Cas9システムにより切断される領域を組み込んだドナーベクターを構築した。さらに、2H2OP法に必要なオリゴDNAやCRISPR-Cas9システムに必要なsgRNAを設計・調整した。方法論の整理やドナーベクターの構築に想定以上の時間がかかってしまったため、これらの材料を用いたゲノム編集作業には着手できておらず、進捗状況はやや遅れているとした。まずはイシガキダイ由来細胞SKF-9におけるChemokine signaling pathwayの複数の遺伝子についてノックアウト試験を実施する予定である。
Strategy for Future Research Activity	ウイルス産生量が低下していた継代数103のSKF-9細胞で、有意に発現変動しており免疫応答にも関与するChemokine signaling pathwayの複数遺伝子を対象としてノックアウト試験を実施する。CRISPR-Cas9システムおよびドナーベクターを用いた2H2OP法により、標的遺伝子をノックアウトすると同時に抗生物質耐性遺伝子および蛍光タンパク質遺伝子をノックインする。抗生物質による選抜を繰り返して、標的遺伝子をノックアウトした細胞株を樹立し、マダイイリドウイルスに対する感受性試験を行う。ウイルス感染細胞におけるCPE発現状況や培養上清中へのウイルス放出量をナイーブなSKF-9細胞と比較することにより、ノックアウト細胞でのウイルス産生量が増加するかどうか検証する。
Causes of Carryover	今年度は、効率的なゲノム編集が可能な試験系の構築において方法論の整理やドナーベクターの構築に想定以上の時間がかかってしまったため、研究の進捗がやや遅れており、ゲノム編集作業には着手できていないために次年度使用額が生じた。