ミトコンドリアDNAのホットスポットに着目した貯穀害虫の地理的多型性解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06334
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 古井 聡 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, 上級研究員 (70391191)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ミトコンドリアDNA / 昆虫組織 / DNA抽出法

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、ノシメマダラメイガ組織からの効率的なミトコンドリア(mt)DNAの単離方法を検討した。均一な性状を特徴とする動物培養細胞については、細胞からミトコンドリアを分離・回収した後にmt DNAを抽出する2ステップ法が一般的である。しかし、多様に分化した細胞の集塊物である組織は、ゲノムDNAの混入を防ぎつつ純度の高いmt DNAを安定的に単離することは極めて困難である。そこで、供試昆虫には、成虫よりも組織の均質性が高くmt DNAの単離が容易かつ安定的に実施できるとの考えから幼虫（全体）を選んだ。また、供試昆虫は、回収したmt DNAの量的な評価を行うため、リアルタイムPCRによる検出手法を報告済みのヒメアカカツオブシムシを用いた。
2ステップ法による市販のミトコンドリアDNA抽出キットについてコントロール実験を実施したところ、OD260nmから算出されたDNA濃度は高く算出されたが、電気泳動においてDNA由来のバンドが全く確認できず、DNAは得られていなかった。原因としては、摩砕操作の不安定性による組織細胞からのミトコンドリアの分離不良、およびミトコンドリア外膜の損傷によるmt DNAの流失等が考えられた。
次いで、プラスミド単離用の市販キットを用いる手法が動物培養細胞からのmt DNAの単離に使用可能で、かつ1ステップで簡便であるとの報告を参考に、動物組織への適用を検討した。幼虫の摩砕条件を緩やかに行ったところ、単離されたDNAの濃度は、念入りに行った試料よりも少なかった。反面、OD260nmから調製した一定量のDNAに含まれるmt DNAのコピー数をリアルタイムPCRによって定量的に比較したところ、緩やかに摩砕を行った試料は、念入りに行った試料よりも約4倍のmt DNAを含むことが確認され、純度や総収量が優れていた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

世界各地のノシメマダラメイガを採集する課題については、コロナウイルスによる影響で全世界的に混乱が続いており、今年度は実施が不可能な状況であった。
ノシメマダラメイガ組織からの効率的なミトコンドリアDNAの単離方法開発については、研究実績の概要に記載した通り、概ね順調に研究が進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

世界各地のノシメマダラメイガを採集し、研究用の試料を入手する課題については、コロナウイルスによる影響で現在も見通しが立たない状況にあるが、世界各国の感染状況を踏まえ、引き続き入手に努力したい。
世界各地から採集したノシメマダラメイガの次世代シーケンサによるミトコンドリア(mt)DNAの解析については、解析用サンプルの入手次第、早急に取りかかりたいと考えている。
ノシメマダラメイガ組織からの効率的なmtDNAの単離方法については、今後は試料量のスケールアップを試み、質とのバランスを考慮して、大量調製が可能な単離手法開発を終える予定である。

Causes of Carryover

世界各地のノシメマダラメイガを採集する課題について、コロナウイルスによる影響で全世界的に混乱が続いており、今年度は実施が不可能な状況であったため、次年度使用額が生じた。当該助成金については、次年度に同課題での繰り越し使用を予定している。