2020 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of calcium signaling mechanism in thermotaxis of bovine sperm and its application to improvement of conception rate

Research Project

Project/Area Number	20K06362
Research Institution	Shinshu University
Principal Investigator	濱野光市信州大学, 学術研究院農学系, 教授 (70303443)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	高木優二信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (20226757)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	精子 / 走温性 / ウシ / カルシウム / 受胎率
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、精子の走温性における運動調節とカルシウムシグナル伝達機構を調べることにより、①カルシウムチャネルの解析から、走温性とカルシウムシグナルの関係が明らかになり、走温性発現精子の運動調節機構が解明できる。　②走温性を指標にした精子の受精能、雄ウシの繁殖能力が評価できる。③繁殖能力の高い雄ウシが選抜され、雌ウシの受胎率が改善し、効率的にウシを増産できる。2020年度は以下のことを明らかにした。１．走温性の発現および運動調節機構の解明：（ 1 ）走温性発現機構の解析：特製チャンバーを利用することで精子の移動能、運動性を詳細に解析できた。顕微鏡に装着した精子運動解析装置を利用し、10秒間、1000画像を記録後、精子の移動方向の変化と尾部運動の正確な解析が可能になった。温度勾配装置を利用して、38～39℃、39～40℃に設定した温度勾配における精子の変化を調べ、低温域から高温域に移動する精子を確認し、ウシ精子における走温性の発現を明らかにした。39～40℃の温度勾配では高温域への精子の移動が抑制された。温度勾配の低温域、高温域、中間域の精子の頭部の運動性を解析し、移動速度、方向転換、移動方向を調べ、低温域の精子が軌跡速度の低下しながら、高温域方向に移動することを確認した。また、尾部打頻度、鞭毛角度、尾部屈曲率を調べ、低温域における鞭毛角度の増大を明らかにした。２．走温性発現経路、伝達機構の解明：（ 1 ）走温性発現精子のカルシウム動態の解析：走温性発現精子の温度勾配、時間経過によるカルシウムの分布と濃度の変化を解明するため、共焦点レーザー顕微鏡により温度勾配各部を移動する精子のカルシウムイオン濃度を調べ、温度一定区と温度勾配区における精子内カルシウムイオンレベルが異なることを確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 低温域から高温域に移動する精子を確認し、ウシ精子における走温性の発現を明らかにした。 39～40℃の温度勾配では高温域への精子の移動が抑制されることを確認した。温度勾配の低温域の精子が軌跡速度を低下しながら、高温域方向に移動することを明らかにした。温度勾配の低温域における精子の鞭毛角度が増大することを確認した。温度一定区と温度勾配区における精子内カルシウムイオンレベルが異なることを明らかにした。
Strategy for Future Research Activity	１．走温性発現および運動調節機構の解明：（２）走温性発現部位の解析：TritonX-100により除膜した精子の温度勾配における尾部の変化を解析し、精子の走温性発現調節部位を同定する。２．走温性発現経路、伝達機構の解明：（ 1 ）走温性発現精子のカルシウム動態の解析：走温性発現精子の温度勾配、時間経過によるカルシウムの分布と濃度の変化を計測することで、走温性発現因子の受容体、発現経路を調べる。：（ 2 ）走温性発現精子におけるカルシウム作用機構の解明：TRPC、細胞内放出チャネル阻害剤： SKF、ライアノジンを添加し、精子の走温性を調べることでカルシウムシグナル伝達機構を明らかにする。３．走温性発現精子の受精機能の解明　：（１）走温性発現精子の超活性化運動の解析：超活性化運動誘起精子を粘性培地内の温度勾配に導入し、頭部の遊泳軌跡、チャンバー内を移動する精子の数と方向の変化の解析から、運動調節機構を解明する。：（２）走温性発現精子の受精能の解析：走温性発現精子の染色性から受精能獲得を、ウシ卵子との体外受精から受精率を調べる。
Causes of Carryover	（理由）独自の事前研究機器、試薬、消耗品により研究ができたため、次年度使用額が生じた。（使用計画）次年度使用額は2021年度請求額と合わせて、ガラス器具、プラスチック製品、酵素、蛍光試薬、凍結ウシ精液、液体窒素を購入し、利用する。