Effects of basement membrane components on oocyte development in vitro

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06372
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 平尾 雄二 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, ユニット長 (10355349)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 卵母細胞 / 体外発育 / 基底膜 / 細胞外マトリックス / マトリゲル

Outline of Annual Research Achievements

平面な培養基質上で哺乳類卵母細胞を発育させる二次元（2D）培養において、発育に及ぼす基底膜（成分）の機能を明らかにする目的で、ウシ初期胞状卵胞から直径約100μmの成熟能力を有さない卵母細胞を含む卵母細胞－顆粒膜細胞複合体を採取して14日間培養し、以下の結果を得た。
1）　培養基質として培養インサートのひとつであるミリセルを選び（対照区）、ミリセル上にI型コラーゲンゲル（セルマトリックス）あるいはマトリゲル（標準タイプ）を塗布した直径数ミリのスポットを作成し、スポット一個あたりに２ないし３個の複合体を載せて培養した結果、いずれの区においても生存と認められた卵母細胞の周囲では顆粒膜細胞によるドームが形成されていた。したがって、卵母細胞による顆粒膜細胞の分化は全ての区で誘導されていた。
2）　I型コラーゲンゲル区では培養の初期に裸化した卵母細胞が多く認められ、それらの周囲ではドームが形成されなかった。このことから、I型コラーゲンゲル区において顆粒膜細胞は速く移動し、卵母細胞の裸化の誘因となったものと考えられる。ミリセルに接着した顆粒膜細胞の移動は比較的遅く、マトリゲル区においても移動が遅かったか、あるいは顆粒膜細胞の増殖が活発で卵母細胞の裸化に至らなかった可能性がある。
3）　卵母細胞の裸化率は培養14日後の生存率に反映され、対照区およびマトリゲル区の卵母細胞の生存率は70％以上であったが、I型コラーゲンゲル区における生存率はその半分程度にとどまった。
4）　一方、培養後の卵母細胞の直径を比較すると、対照区、I型コラーゲンゲル区、マトリゲル区がそれぞれ114.2μm、117.3μm、113.1μmであり、対照区とマトリゲル区では110μm未満の卵母細胞の割合が高かったことから、卵母細胞の生存率と発育速度についてさらなる検討が必要と考えられる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

基底膜を含まず、成長因子などの成分も含まない基質としてミリセルの利用が有効であることを確認できたことから、本研究期間を通して対照区としての利用が確定した。ミリセル区と比較した場合のI型コラーゲンゲル区およびマトリゲル区におけるウシ卵母細胞の生存率と発育の程度について知見を得ることができ、知見の内容に基づいて次年度以降の研究を進められる点において進捗している。
一方、令和2年度に計画されていて実施されていない項目がある。主な理由として年度初頭からCOVID-19対策として行われた全国的な活動の制限にあり、具体的には実験材料のウシ卵巣が一時的に入手困難な状況となり、さらに同時期に研究活動がベンチワークではなく情報収集や情報整理に偏ったという経緯がある。
当初計画においては、数社によって市販されている基底膜を模したゲルについて、マトリゲルとその類似品を二社から選んで効果を比較検討するとしていたが、マトリゲルに関しての検討のみにとどまった。マトリゲルの効果に関する知見は得られたが、他社製品との比較はまだされておらず、今後計画されているマトリゲルに含まれる個々の因子の影響を調べる前に他社製品との比較を行う。また、顆粒膜細胞における遺伝子発現への影響をRNAseqで確認することも予定されていたが、サンプルの採集は進んでいる一方、比較対象の絞り込みが必要である。

Strategy for Future Research Activity

本年度の実験結果から、長期培養で問題となる顆粒膜細胞の遊走状態の制御において基質およびゲルの選択が極めて重要であることが確認されたことから、当初の計画から大きな変更なく次年度以降の実験を遂行する。
三年間を通した計画では、次年度には市販のゲルに含まれる成長因子が卵母細胞の発育に悪影響を及ぼす能性があるとして、標準タイプと成長因子低減型の効果を比較することを最初に掲げていた。しかし、進捗上の問題として一社が提供する標準タイプのマトリゲルの検討にとどまっていることから、まず他のマトリックス製品による培養を実施して作用を比較し、その上で成長因子低減型との比較へと進める。次いで、構成成分の影響を個別に検証する。マトリックス成分は、ラミニン、IV型コラーゲン、エンタクチン等であり、成長因子はbFGF、EGF、IGF-1、TGF-β、PDGF、NGFである。ウシ卵母細胞を用いた培養でそれら全てを検討することは困難であることから、マウス発育途上卵母細胞用の従来の培養系をミリセル上で発育させる培養系へと改変して利用する。
それらの結果を踏まえて、令和4年度では添加する基底膜構成要素を決定し、作出した卵母細胞に由来する体外受精胚の受胎性を検証する。

Causes of Carryover

本年度初頭からCOVID-19対策として行われた全国的な活動の制限に伴い、実験材料のウシ卵巣が一時的に（3ヶ月程度）入手困難な状況となったこと、さらに同時期に研究活動がベンチワークではなく（比較的経費のかからない）情報収集や情報整理を主となったことから、採材のための出張旅費や実験遂行のための消耗品費などが計画通りの使用とならず、次年度使用額が生じることとなった。
次年度においては、本年度に収集した情報を活用して実験内容を充実させるだけでなく、外部からの材料入手に併せて自家繁殖マウスを利用することで進捗状況の停滞を防ぎ、またサンプルの分析を発注するなどアウトソーシングの利用を含めて次年度使用額を活用する。