2021 Fiscal Year Research-status Report
旋毛虫分泌タンパク質による宿主筋肉細胞変異の分子生物学的および構造生物学的解析
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20K06390
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| Research Institution | Gifu Women's University |
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Principal Investigator |
長野 功 岐阜女子大学, その他の研究科, 講師 (40283296)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前川 洋一 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 教授 (10294670)
鎌足 雄司 岐阜大学, 高等研究院, 助教 (70342772)
呉 志良 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 講師 (90313874)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 旋毛虫 / 筋肉細胞変異 / 筋肉細胞分化 / Ts43タンパク質 / 遺伝子発現 / タンパク質の立体構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
旋毛虫は寄生した宿主筋肉細胞を自己の生存に適した細胞（ナース細胞）に変異させて寄生を続ける。われわれは、今までに感染筋肉細胞のナース細胞への変異過程において、筋肉幹細胞が増殖・活性化し、筋肉細胞が未分化細胞へ脱分化・再分化、アポトーシスを起こすことを明らかにしてきた。
旋毛虫が分泌する43kDaタンパク質はこのような変異に最も重要な役割を担っている可能性が高いと示唆されているが、今年度の研究では、旋毛虫筋肉幼虫の43kDa 分泌タンパク質の筋細胞の分化、アポトーシスおよび細胞の変異に対する影響を詳細に検討した。まず、旋毛虫の分泌タンパク質のプロテオーム解析を行ったところ、旋毛虫の成虫および筋肉幼虫がDNase II ドメインを持つ43kDaのタンパク質を大量に分泌することが明らかになった。また、分泌タンパク質のアミノ酸シークエンス解析では、成虫、新生幼虫および筋肉幼虫それぞれに特異的なDNase II分泌タンパク質が存在し、それらはそれぞれの発育段階に固有な役割を担っていると考えられた。筋肉幼虫特異的な43kDa DNase IIドメイン発現ベクターを筋芽細胞株（C2C12）に導入発現させた結果では、筋分化調節因子（myogenin, MyoD, Mef2c, Myh2, Myh3）, アポトーシス関連遺伝子(Tnfa, Cas3, Cas9, Bcl2, BAX,Apaf-1)、および細胞分化・変異関連遺伝子(c-Ski, Tgfb, Smad)の発現に大きな変化がみられ、ナース細胞形成時に起きる再分化、アポトーシスおよび細胞変異に関与することが明らかになった。
また、前実験の段階ではあるが、転写因子の転写活性に対するTs43タンパク質の作用についての解析をルシフェラーゼアッセイにより行った結果、AP-1およびNF-κBの転写活性に有意な変化が見られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前年度はTs43タンパク質のC2C12細胞での遺伝子発現実験を行い、DNase II ドメインの役割について集中的に解析し、おおむね目標を達成できたが、いまだ転写因子の転写活性に対するTs43タンパク質の作用についての解析実験については、前実験の段階である。
また、TS43の構造生物学的解析においては、用いた大腸菌株による組換えタンパク質ではTs43タンパク質の収量が多くないことが分かったために、現在シャペロン導入大腸菌におけるタンパク質発現を継続中である。しかし、異なる組み合わせのシャペロンとTs43タンパク質の大腸菌内での共発現を行っているために時間を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、前年度に実施できなかった研究計画を実施する。すなわち、筋芽細胞株（C2C12細胞）にTs43の小麦胚芽組換えタンパク質を核内にin vitroで投与した場合の細胞の形態学的変化および発現タンパク質の観察を行う。また、転写因子AP-1およびNF-κBの転写活性に対するTs43の作用についての解析を完了させる。
次に、今年度の主要な実験であるRNAインターフェレンス（RNAi）解析によりTs43の筋肉細胞変異における役割を解明する。その後にTs43 遺伝子をノックインしたトランスジェニックマウスを作製し、筋肉細胞変異をin vivoで再現することを試みる。
また、TS43の構造生物学的解析実験においては、シャペロン導入大腸菌によるTs43の組換えタンパク質を大量に合成・精製し、タンパク質が正しい構造をとっているかどうかを一次元NMR法で確認し、円二色性分光法を用いて二次構造を調べる。その後可能であれば、結晶化によるＸ線結晶構造解析法を用い三次構造を決定する。
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| Causes of Carryover |
Ts43タンパク質による筋肉細胞変異の分子生物学と的解析においてはTs43の小麦胚芽組換えタンパク質を核内にin vitroで投与した場合の解析転写活性解析が完遂できなかったために若干の余剰金が生じた。
また、構造生物学的解析が当初の計画から遅れたため未使用分が生じた。遅れた理由は、用いた大腸菌株による組換えタンパク質ではタンパク質の収量が多くないことが分かり、それ以後に続く研究が完遂できなかったからである。現在種々のシャペロン導入大腸菌におけるタンパク質発現を試みているところであり、未使用分は、シャペロン関連試薬の購入および今年度にできなった構造生物学的解析実験に用いる試薬類を購入する予定である。
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[Journal Article] Efficacy of Dipterocarpus alatus oil combination with Rhinacanthus nasutus leaf and Garcinia mangostana pericarps against canine demodicosis2021
Author(s)
Atchara Artchayasawat, Parichart Boueroy, Thidarut Boonmars, Benjamabhorn Pumhirunroj, Pranee Sriraj, Ratchadawan Aukkanimart, Sirintip Boonjaraspinyo, Opal Pitaksakulrat, Panaratana Ratanasuwan, Apiporn Suwannatrai, Chatanun Eamudomkarn , Porntip Laummaunwai , Wu Zhiliang
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Journal Title
Vet World
Volume: 14
Pages: 2919-2928
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Kaempferol Has Potent Protective and Antifibrillogenic Effects for α-Synuclein Neurotoxicity In Vitro.2021
Author(s)
Inden M, Takagi A, Kitai H, Ito T, Kurita H, Honda R, Kamatari YO, Nozaki S, Wen X, Hijioka M, Kitamura Y, Hozumi I
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Journal Title
Int J Mol Sci. 22, 11484
Volume: 22
Pages: 11484
DOI
Peer Reviewed / Open Access
