糖鎖プロファイルに着目したプリオン株生成機構解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06403
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 岩丸 祥史 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門, グループ長補佐 (20355142)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 舘野 浩章 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (30450670)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: プリオン / スクレイピー / 異常プリオン蛋白質

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、プリオンの主要構成成分である異常プリオン蛋白質の糖鎖構造に着目し、高密度レクチンアレイを用いて異常プリオン蛋白質の糖鎖プロファルを取得し、プリオン株の簡便な識別法の確立と、プリオン株が多様な生物学的性状を示す機構を明らかにすることを目的とする。プリオン株としてマウススクレイピーChandler、 ME7、22L株を用いた。近交系マウス（CD-1マウス）に各プリオン株マウス脳乳剤を脳内接種し、約150日後に病末期のマウス脳を回収した。陰イオン性界面活性剤添加緩衝液を用いて脳乳剤を作製し、核酸分解酵素処理に続き、蛋白質分解酵素処理を行った。高速遠心後の上清を超遠心し、沈殿画分を得たのち、超音波処理による陰イオン性界面活性剤添加緩衝液への分散後に再度超遠心を行い、部分精製異常プリオン蛋白質を得た。陰性コントロールとして、正常脳を同様に処理した検体を作製した。この際、Chandler株由来の異常プリオン蛋白質の回収量が他の株と比較して低く、1/10程度であった。そのため、部分精製方法を一部変更し、SDS-PAGEゲルの銀染色で検出可能なレベルの量を回収できるように改良をおこなった。銀染色法で解析したところ、異常プリオン蛋白質以外のバンドは検出されず、精製度が高いことが明らかとなった。また、ウエスタンブロット法で異常プリオン蛋白質検出を行ったところ、全ての株から銀染色のシグナルと同じ分子量の位置にシグナルが検出された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

COVID19の発生を受けた感染拡大防止措置として、在宅勤務の導入や出張制限が行われたことにより、試料の作成と解析に遅延が生じたため、

Strategy for Future Research Activity

部分精製異常プリオン蛋白質をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）存在下で加熱し、脱凝集と同時に不活化を行う。部分精製異常プリオン蛋白質を、蛍光色素（Cy3）と反応させ標識する。蛍光標識後、余分な色素をSephadexG25カラムで除去する。蛍光標識した部分精製異常プリオン蛋白質を高密度レクチンアレイに反応させ、糖鎖プロファイリング解析を行う。

Causes of Carryover

COVID19の発生を受けた感染拡大防止措置として、在宅勤務の導入や出張制限が行われたことにより、試料の作成と解析に遅延が生じた。部分精製した異常プリオン蛋白質の蛍光標識と、高密度レクチンアレイへの反応を行う。