2021 Fiscal Year Research-status Report
Novel screening system expressing human metabolic enzymes in vivo
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20K06416
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| Research Institution | Rakuno Gakuen University |
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Principal Investigator |
寺岡 宏樹 酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (50222146)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
生城 真一 富山県立大学, 工学部, 教授 (50244679)
小林 麻己人 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (50254941)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 実験動物代替法 / ゼブラフィッシュ / トランスジェニック動物 / 代謝酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1）3種のhCYPs（hCYP1A1、3A4、3A7）を発現させた胚稚魚を成魚まで育てて交配したところ、hCYP1A1と3A7のEGFP蛍光を全身に発する陽性胚稚魚（F0）を見つけることができた。これらをさらに継代した。 2）hCYP3A7-F3にhCYP3A7 RNAプローブを用いたWhole mount in situ hybridizationを行ったところ、蛍光陽性胚稚魚で全身に斑状の発現が認められたが、F0に比べて弱い傾向があった。また、卵黄嚢と体幹の境界部および尾ビレの先端に限局して強い発現がみられた他、左右差も認められた。 3）hCYP3A7の陽性TG胚稚魚（F3）にサリドマイドを暴露したところ、胸ビレの低形成や浮腫を示す個体を認めた。一方、EGFP蛍光陰性の対照群、および野生型はサリドマイドに対して全く感受性を示さなかった。 4）アクチンプロモーターにヒトシクロオキシゲナーゼ1（hCOX1）（ロスタグランジンHシンターゼ１）、ラットCYP2E1（rCYP2E1）（F0）とEGFPをつなげたtoll2プラスミドを作成してセブラフィッシュ胚に注入したところ、全身にモザイク状のEGFP蛍光を確認できた。このうち、rCYP2E1 F0は受精後55 hrにおけるアセトアミノフェンに対する毒性が増強した。hCOX1 F0に対する化合物暴露については現在、検討中である。
ヒトやラットなどの哺乳動物の主要代謝酵素であるいくつかのCYPsを、F0だけでなくTGとしても、ゼブラフィッシュ胚稚魚に発現させることができた。しかし、全身に発現させたことで活性が強い稚魚は死亡率が高いのか、これらCYPsの代謝活性はやや弱い可能性が危惧される。現在、CYPを肢芽や一部の組織に特異的に発現するTGの開発を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ゼブラフィッシュの産卵状態が悪化したため。受精卵から繁殖可能な成魚まで3ヶ月程度必要とすることから、実験に大きな影響を与えた。現在、ろ過材を別の種類に代えて対応している。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）hCYP3A4のTGフィッシュの確立を継続して行う。すでにhCYP1A1、3A7についてもEGFP蛍光が弱く、CYPs発現も同様と思われることから、強く発現する系統を選抜する。CYPs発現量の発達段階における変化についても確認する。 2）hCYP3A7 TGとF0胚稚魚を用いて、セレブロン、fgf8、およびこれらをつなぐ経路に関与する遺伝子群のサリドマイド毒性における関与を検討する。ウサギを用いてサリドマイド毒性における関与が報告されている酸化ストレスについても検討する。 3）ウサギを用いてサリドマイド毒性における関与が報告されているCOX1について、hCOX1 F0胚稚魚モデルを中心に検討する。
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| Causes of Carryover |
前年度から続くCOVID-19対応で研究活動が制限された影響もあり、ゼブラフィッシュの産卵、生育成績が悪化したため、十分な解析を行うことができなかった。次年度はこれらをを改善することで、本年度分も含めて解析を行う。
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