Establishment of bovine intestinal organoid

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06421
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 鈴木 亨 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門, 上級研究員 (10362188)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 腸管オルガノイド / in vitro培養 / 腸管上皮幹細胞 / シグナル伝達経路 / 制御因子 / 自己複製能

Outline of Annual Research Achievements

家畜の下痢は、発育や体調管理の阻害要因となっているばかりでなく、生産活動と直結するため、看過することはできない。家畜に下痢などの消化器病を引き起こす原因の大半はウイルスであり、ウイルスを制御あるいは感染予防するためには、ウイルスの性状の把握と感染・発病メカニズムなどを知ることが重要である。主要家畜である牛の消化器病ウイルスの感染・発病メカニズムを解明する上で動物実験は欠かせないが、コスト、労力および施設の問題に加え、社会環境の変化から牛を用いた動物実験の実施は困難であり、これに代わる研究ツールの開発が急務の課題である。本研究では、他の動物種に比べて研究が遅れている牛の消化器病ウイルスに関して、その研究を飛躍的に発展させるためのツールとして、実験室内で取扱うことができる牛個体の腸管構造と機能を備える腸管オルガノイドを樹立し、さらにそれを用いたウイルス実験感染系を確立することを目的とするが、今年度は主として牛腸管オルガノイドを世界に先駆けて樹立する。
牛の小腸および大腸からそれぞれ腸管上皮幹細胞を採取し、それらをin vitroで連続して培養・維持するために、従来の4種類の必須なシグナル伝達経路制御因子に新たに3種類の制御因子を加えた計7種類の制御因子を用いることで、牛小腸および大腸各種の腸管オルガノイドの樹立に成功した。樹立した牛腸管オルガノイドは10代連続して継代することができ、また遺伝学的に自己複製能が維持されていることを実証した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

腸管オルガノイドを樹立するためには、腸管上皮幹細胞をin vitroで培養することが不可欠である。また、その腸管上皮幹細胞を培養するためには、腸管組織の恒常性を維持する4つのシグナル伝達経路を制御することが重要である。今年度、すでに他の動物種で必須であることが分かっている4つの制御因子（Wnt、EGF、Noggin、R-spondin）に新たに３つの制御因子を加えることで、牛腸管オルガノイドの樹立に成功した。また、樹立した牛腸管オルガノイドはその最適培養条件下で10代連続して培養しても自己複製能が維持されていることを確認した。合わせて、樹立に用いた腸管上皮幹細胞と10代継代後の腸管オルガノイドとの間で各種マーカー遺伝子に関する発現プロファイルを比較・解析した結果、両者の発現プロファイルが一致したことから、自己複製能が維持されていることを実証した。これらの成果はいずれも当初の計画通りに進行していることを表している。

Strategy for Future Research Activity

腸管オルガノイドの特徴の１つである自己複製能についてはすでに実証済みであることから、次年度もう一つの特徴である全ての腸管上皮細胞（吸収上皮細胞および分泌系細胞（パネート細胞、杯細胞および内分泌細胞））への多分化能について組織形態学的に検証する。また腸管オルガノイドを用いた消化器病ウイルスの分離に向けて、腸管上皮細胞を特異的に分化させる最適条件を検討する。