2020 Fiscal Year Research-status Report

がんスフェロイドのアポトーシス誘導に関与するヒアルロン酸－TRPチャネル制御系

Research Project

Project/Area Number	20K06437
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	山崎純日本大学, 生物資源科学部, 教授 (50230397)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	岡村和彦福岡歯科大学, 口腔歯学部, 准教授 (00224056) 内田邦敏静岡県立大学, 食品栄養科学部, 准教授 (20581135)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	TRPチャネル / ヒアルロン酸 / がんスフェロイド / アポトーシス / 細胞浸潤
Outline of Annual Research Achievements	正常細胞は細胞外基質（ECM）との接着を失ったときにアポトーシスになるが、それに対して抵抗性を持つことはがん細胞が転移能をもつことに繋がる。これまでに遊走能や浸潤能を高める因子としてのヒアルロン酸（HA）の役割や、HAのTRPチャネル活性への関与が示唆されてきた。以上の知見を踏まえて、がんスフェロイド形成とアポトーシス回避に寄与するHAとTRPチャネルの関与を明らかにすることが本研究の目的である。イヌならびにヒト乳がん細胞において、poly-(2-hydroxyethyl methacrylate) (poly-HEMA)コート培養ディッシュ上ではECMとの接着を失う一方、スフェロイドの形成によってアポトーシスからの回避が認められた。スフェロイド形成で増加するTRPチャネルを検索したところTRPV1やTRPV6などの候補が得られた。本助成事業の補助によって構築した細胞内Caイメージングシステムを用いて、イヌTRPV1チャネルを強制発現したHEK293細胞におけるチャネル活性化のHAによる作用を調べたところ、チャネル刺激薬による細胞内Ca濃度の増加は高分子HAによって抑制されることが明らかになった。また、poly-HEMAディッシュ上のヒト乳がん細胞ではHA分泌が増加しTRPV6発現が増加したが、HA合成阻害薬によってTRPV6発現が減少し、アポトーシスが惹起されることが明らかになった。他方、乳がん細胞を真皮モデルに播種してがん浸潤プロセスを再現する3次元実験系を構築した。悪性度が異なる細胞を比較したところ、浸潤距離の差とHA合成阻害薬による抑制が認められた。以上の研究成果をさらに展開して、HAとTRPチャネルの相互作用の違いをもとにして、がんスフェロイド形成とアポトーシス耐性能ががん細胞種で異なる現象を明らかにし、浸潤を抑制するがん薬物療法を探索する取組みを進めていく。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason がん細胞がアポトーシスを回避する戦略の１つにスフェロイド形成があり、イヌ乳腺腫瘍ではヒアルロン酸（HA）が細胞集団の形成に寄与することが明らかになっている。HA とTRPチャネルの関連性を示す知見を踏まえて、先ずがんスフェロイド形成とアポトーシス回避に寄与するHAとTRPチャネルの関与を明らかにすることが本研究の目的である。本年度は、poly-(2-hydroxyethyl methacrylate) (poly-HEMA)コート培養ディッシュ上でアポトーシスから回避したイヌ（AZAC-Bなど）ならびにヒト乳がん細胞（MCF-7, MDA-MB-231など）で増加するTRPチャネルを検索したところ、TRPV1やTRPV6などの候補が得られた。イヌTRPV1チャネルのPCRクローニングによって発現ベクターを作成した上で、強制発現HEK293細胞を用いてチャネル活性化のHAによる作用を調べた。本助成事業の補助によって構築した細胞内Caイメージングシステムを用いて、TRPV1チャネル刺激薬（カプサイシン）による細胞内Ca濃度の増加は高分子（平均1MDa）HAによって抑制されることが明らかになった。また、poly-HEMAディッシュ上のヒト乳がん細胞ではHA分泌が増加しTRPV6発現が増加したが、HA合成阻害薬4-methylunbelliferoneによってTRPV6発現が減少し、アポトーシスが惹起されることが明らかになった。他方、乳がん細胞を真皮モデルに播種して細胞集団が浸潤するプロセスを再現する3次元実験系を作成した。悪性度が異なるMCF-7とMDA-MB-231を比較したところ、MDA-MB-231の方が長い浸潤距離を示し、HA合成阻害薬によって抑制されることが明らかになった。現在、がん細胞の浸潤におけるHAの影響に対するTRPVチャネルの役割を検討している。
Strategy for Future Research Activity	正常細胞は細胞外基質（ECM）との接着を失ったときにアポトーシスになるが、それに対して抵抗性を持つことはがん細胞が転移能をもつ理由の一つである。これまでに遊走能や浸潤能を高める因子としてヒアルロン酸（HA）の役割が示唆されてきた。また、近年HAの TRPチャネル活性への関与が報告されている。以上の知見を踏まえて、次年度からは細胞内Caイメージングに加えてwhole-cell パッチクランプ法によるHA産生とTRPV1活性との機能的連関について検討を進め、高分子HAによる反応に加えて、機能が異なるとされる低分子（平均数十kDa）HAの効果についても検討を加える。さらに、poly-HEMAコート培養ディッシュ（がんスフェロイドの形成）や３次元真皮モデル（がん細胞集団の浸潤能）を活用して、アポトーシスから回避する機構としてのHAとTRPチャネルの相互作用を明らかにする予定である。また、これらの相互作用の違いをもとにして、がんスフェロイドの形成とアポトーシス耐性能ががん細胞種で異なる現象を明らかにしていく。TRPの活性化薬・阻害薬投与によって、HA接着が寄与するスフェロイド形成が抑制されアポトーシスを惹起できるか否かの検討を通じて、浸潤能を抑制するがん薬物療法を探索する取組みとして継続していきたい。