犬横紋筋肉腫細胞株エクソソームの特性変化を支配するインデューサー因子の探索

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06438
• Research Institution: Nippon Veterinary and Life Science University
• Principal Investigator: 佐藤 稲子 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 講師 (70633478)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 片山 欣哉 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 准教授 (60344298) ; 田崎 弘之 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (80231405)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: エクソソーム / 犬横紋筋肉腫

Outline of Annual Research Achievements

エクソソームは様々な細胞によって放出され、ほとんどの体液中に見られる細胞外膜小胞である。エクソソームは、癌や肉腫の診断および予後を予測するためのバイオマーカーとなりうると考えられている。犬腫瘍に関しても、症例数の多い乳腺腫瘍等のエクソソームの機能解析は進められつつあるが、犬の横紋筋肉腫については、その希少性ゆえにエクソソームの解析は未着手である。本研究では、本学で樹立された犬横紋筋肉腫細胞株が分泌するエクソソームについて、培養条件の違いによるエクソソームの特性変化を明らかにする。
さらに、特性が変化したエクソソームを犬正常骨格筋細胞に添加することで、正常細胞への影響を解析・評価する。エクソソームの特性コントロールが可能となれば、エクソソームを介した細胞間コミュニケーションを封じるというこれまでにない新たな戦略によって、エクソソームの予防的・治療的な活用という新領域への発展が期待できる。
2020年度は、本研究の初年度であり、基盤となる犬横紋筋肉腫細胞培養条件の検討とエクソソームの回収方法の検討をまずは計画通りに実施した。また、核酸分析を実施する計画も2020年度に計画しており、miRNAの分析を実施した。さらに、高密度と低密度での培養条件を変更したエクソソームについてメタボローム解析も試みた。
エクソソームの回収は超遠心法によって実施し、電子顕微鏡での画像、ナノサイトによる粒子径の分析、マーカーであるCD9の定量で、エクソソームの回収を確認できた。また、回収したサンプルからはmiRNAが検出され、また、高密度、低密度による培養条件に違いによってエクソソームの代謝プロファイルが異なることが明らかになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2020年度の計画は細胞培養条件の検討とエクソソームの回収および、回収後の核酸分析と解析であった。これらについては順調に進捗し、安定してエクソソームの回収やその後の分析をするに至っている。

Strategy for Future Research Activity

2021年度はすでに結果を得たmiRNA分析結果を基に関連するmRNAの定量、およびタンパク質について、二次元電気泳動（本学所有Amersham二次元電気泳動装置）後、スポットの比較を行う。発現量が有意に異なるタンパク質については、MALDITOF/TOF-MS（本学所有Bruker autoflex speed）により、peptide mass fingerprinting(PMF)を行い、mascot等のデータベースにより同定し、分類する。また、密度条件を違えて培養した細胞のエクソソームについて明らかに異なるプロファイルが示されたが、その解釈について検討する。

Causes of Carryover

2020年度末にプラスチック消耗品を必要に応じ発注していたが新型コロナウィルス感染症蔓延により、これらの消耗品の入手が滞り、予定の購入ができず残額が生じた。消耗品については継続した発注をしており、2020年度の残予算は2021年度に使用する予定である。
また、2021年度の予算については、予定通り、核酸解析やプロテオーム、メタボロームに関わる消耗品、委託分析に使用する。