2021 Fiscal Year Research-status Report
In situエピジェネティクス：分化・発生のH3K27me3機能解析の新戦略
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20K06449
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
新井 大祐 早稲田大学, 理工学術院, 講師(任期付) (20624951)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス / エピゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では「ゲノム上の特定の領域のH3K27me3の機能解析（in situエピジェネティクス）」の手法を確立し、細胞分化に伴うNodal遺伝子のH3K27me3による制御機構の解明を目指している。昨年度に引き続き、in situ H3K27me3調節ツールとしてDNAメチル化酵素補因子であるDNMT3Lを融合したCRISPR/dCas9発現ベクターを作製した。またPRC2の働きに拮抗すると考えられるH3K27me3脱メチル化酵素JMJD3、同アセチル化酵素P300についても同様の発現ベクターを作製した。Nodal遺伝子を対象として機能の検証を進めている。
研究ツールとして様々なノックイン・ノックアウト細胞を作出する必要があるが、従来の方法は効率が低いうえに非特異的なドナーの挿入が多いという問題があった。そこで作業の効率化を試みた。NHEJとMMEJの同時阻害により非特異的な挿入を抑制しつつ高効率にHDR両アリルノックインを達成する新手法（BiPoD法）を確立し、論文として発表した。
これまでは細胞集団の遺伝子発現レベルをqRT-PCRにより解析していたが、エピジェネティックな変化は一部の細胞でのみ起こっている可能性もある。そこでBiPoD法を用い、マウスES細胞においてNodal遺伝子の直下に2A-mCherryタグをノックインした。この細胞株により、発現状態を１細胞レベルでリアルタイムにモニターすることが可能になった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度末に実験室が被災し、研究の遂行が大きく妨げられたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
開発したin situ H3K27me3調節ツールとモニター用細胞を用いて、H3K27me3のNodal遺伝子発現への効果を検証する。またノックイン新手法を活用してPRC2スイッチES細胞を完成させ、in situ H3K27me3調節ツールと組み合わせて分化時のH3K27me3の役割を解明する。
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| Causes of Carryover |
実験室の被災により、計画していた実験の多くを実施できなかったため、大きな余剰額が生じた。研究体制は元に戻りつつあり、余剰予算を用いて前年度に予定していた研究を順次遂行していく。
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