2023 Fiscal Year Annual Research Report
In situエピジェネティクス：分化・発生のH3K27me3機能解析の新戦略
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20K06449
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
新井 大祐 順天堂大学, 医学部, 助教 (20624951)
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2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス / エピゲノム編集 / ノックイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では「ゲノム上の特定の領域のH3K27me3の機能解析（in situエピジェネティクス）」の手法を確立し、細胞分化に伴うNodal遺伝子のH3K27me3による制御機構の解明を目指している。これまでに下記の成果を得た。
1. in situ H3K27me3調節ツールとしてPRC2の構成因子であるEZH2、EED、JARID2などをdCas9を融合したエピゲノム編集ベクターを作製した。これをES細胞に一過的に導入し、Nodal遺伝子に対するsgRNAとともに発現させてNodal遺伝子のmRNA発現への影響を調べたところ、抑制効果は認められなかった。一方、dCas9-KRABとの共発現では弱い抑制効果が5日間持続した。転写活性状態にある遺伝子をPRC2単独で十分に抑制することはできないと考えられた。酵素の組合せによる相乗効果を狙い、他のH3K27関連酵素（JMJD3、P300、DNMT3L）のエピゲノム編集ベクターも作製し、検討を進めている。
2. ES細胞に対し、非特異的な挿入を抑制しつつ高効率にHDR両アリルノックインする新手法（BiPoD法）を確立した。本法の工夫によりROSA26領域に異なる配列をヘテロで同時挿入することができるようになった。
3. H3K27me3とPRC2自身のどちらが機能に必要なのかを調べるために、H3K27me3の機能とPRC2の非触媒性の機能を独立にON・OFF可能なES細胞（PRC2スイッチES細胞）の作出を進めた。AID（Auxin inducible degron）タグのノックインにより内在性EZH2タンパク質が1時間以内に分解可能であることを確認した。さらにOsTIR（F74G）の発現カセットと酵素活性を持たないEZH2変異体のTet-ON発現カセットをROSA26領域にノックイン導入したES細胞株を樹立した。
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