2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K06457
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
日下部 博一 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (60344579)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | マウス / フリーズドライ卵 / 染色体 / ミニ卵 / 再構築卵 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、マウスの卵を凍結乾燥（フリーズドライ）して、マウス未授精卵の冷蔵または室温保存法を確立することを目的とする。フリーズドライされた未受精卵を水でもどして回収さえできれば、たとえ「死んだ卵」であっても、それをドナー卵として別の新鮮なレシピエント卵（除核した卵）に移植し、フリーズドライ卵核に由来する再構築卵を作製すること可能かどうかを検討した。研究の第一歩として、排卵直後の未受精卵の卵細胞質内にある染色体に少量の卵細胞質を含む「ミニ卵」（直径はおよそ10～20μm程度）を作製する必要があった。ミニ卵をフリーズドライし、加水後に別の新鮮な徐核卵に注入する試みであるが、この「ミニ卵」を作製するためには卵全体を高張液で処理して卵全体を小さくする方法と、サイトカラシンBで処理された未受精卵からマイクロインジェクション用ピペットで染色体を吸引して取り出し、これをそのまま「ミニ卵」とする方法の２種類を試した。前者の高張液処理法では、フリーズドライ前には卵の直径が二分の一以下に小さくなるものの、これをフリーズドライ後に加水しても、マイクロインジェクション用ピペットでピックアップできるほどの小さな卵にはならなかった。後者の染色体吸引法では、染色体を含む小さな「ミニ卵」ができ、これをフリーズドライ後に加水すると、新鮮な除核卵に移植できるほどの小さなフリーズドライ「ミニ卵」を作製できることがわかった。問題点は、フリーズドライ操作によって崩壊するためか、回収率が半分以下になってしまうことである。現時点では、フリーズドライ後のミニ卵の回収率を高めることと、フリーズドライミニ卵に由来する再構築卵が正常であること（受精可能かどうかも含めて）を確認することが急務である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
令和２年度は、旭川医科大学におけるSPF動物実験施設の新設による動物実験室の引っ越しと、世界的な新型コロナウイルス感染拡大による研究活動の制限や動物実験施設への入室制限が重なり、研究全体の遂行に大きな遅延が生じ、実験できる少ない時間のほとんどを予備検討に費やさざるを得なかったことによる。
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| Strategy for Future Research Activity |
フリーズドライ「ミニ卵」から作製した再構築卵から受精卵を作製することが可能かどうかを調べる。また、チューブリン抗体による免疫染色法で、卵細胞質内の紡錘糸（スピンドル）の正常性を確かめる。さらに再構築卵や受精卵の第一卵割中期で染色体標本を作製し、通常の染色体分析または分子細胞遺伝学的手法による染色体の染め分けによって各染色体が正常に分割されていることを確認する予定である。
昨年度、乾燥剤であるトレハロース等を含ませた溶液でフリーズドライを行うと、トレハロースはミニ卵を崩壊させにくくするが、ミニ卵を固くすることがわかったため（柔軟性に乏しくなる）、適切な濃度条件を決める必要がある。また、細胞膜に孔を形成するタンパク質「へモライシン」でミニ卵を処理し、耐乾燥剤のミニ卵細胞質への流入を許すことで、フリーズドライ操作中のミニ卵の崩壊が抑制され、再加水後のミニ卵の回収率が改善するかどうかを調べる。
もし、ミニ卵由来の受精卵を作製できるのであれば、体色の異なる系統間でドナー卵（フリーズドライミニ卵）とレシピエント卵（徐核卵）を用意して再構築卵を作製し、受精後に生まれてくる個体の体色を観察してフリーズドライミニ卵由来の個体を作出することが可能であることを視覚的に証明したい。
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| Causes of Carryover |
旭川医科大学のSPF動物実験施設の新設による動物実験室の移設作業や、世界的な新型コロナウイルス感染拡大により動物実験を行う機会に制限がかかったため、研究が予定通りに進まず、研究成果としての論文発表ができなかったことや、関係学会への参加を見合わせたため、旅費や投稿料などの費用がかからなかったことによる。次年度使用額は、分子生物学的実験用の試薬か、もしくは顕微鏡の付属品などの購入費用に充てる予定である。
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