トランスジェニックヌードマウスを利用した精原幹細胞異種移植法の開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06462
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 垣内 一恵 北里大学, 獣医学部, 助教 (90509184)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高岸 聖彦 北里大学, 獣医学部, 講師 (20216633) ; 久保田 浩司 北里大学, 獣医学部, 教授 (80263094)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 精原幹細胞 / 異種移植 / 精子形成

Outline of Annual Research Achievements

家畜の精原幹細胞の同定、及び培養系の樹立が試みられているが、レシピエントとなる不妊オス個体の作製が困難なため、精原幹細胞の幹細胞活性を評価できずに研究の進展が妨げられている。本研究課題では、精原幹細胞の分化誘導因子の種特異性に着目した異種移植法の確立を目指す。
レシピエントマウス精巣に異種精原幹細胞を移植した場合、精細管内で維持はされるが精子への分化は認められないことが明らかになっている。申請者は、精原幹細胞の分化因子に種特異性が存在すると仮定し、レシピエントマウスの精巣において、ドナー動物種由来の分化因子を発現するトランスジェニックマウスを作製し、精原幹細胞の異種移植により継続的な他動物種由来の精子形成の再構築を試みる。異種移植には、既に前精原幹細胞（精原幹細胞の前駆細胞）の精製法が確立し、体外受精や受精卵の体外培養による胚発生能の有無を解析できるブタをモデルにし、ブタ由来の精原幹細胞の分化誘導因子を発現する発現ベクターを作製し、トランスジェニックマウスの作製を試みた。
これまでに、トランスジェニックマウス作製のための発現ベクターの構築と予備実験を行った。分化誘導因子を過剰発現したトランスジェニックマウスは皮膚への異常が認められることが報告されているため、当初の研究計画では、精巣組織内のセルトリ細胞で特異的に発現するヒトAMHプロモーターの下流で発現を誘導することとしたが、予備実験によりAMHプロモーターは成体マウスセルトリ細胞では発現を誘導しない可能性を示した。そこで、新たにセルトリ細胞特異的プロモーターを選択し発現ベクターを構築したところ、成体マウス由来セルトリ細胞株において発現が認められたため、現在トランスジェニックマウスの作製を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画で使用する予定であったAMHプロモーターは、成体マウス精巣で機能しない可能性が示されたため、精巣組織で特異的に機能するプロモーター配列の選択を再検討するために時間を要した。進捗が遅れたが、無事に成体マウス精巣で機能するプロモーター配列を選択し、トランスジェニックマウスの作製を開始することができた。

Strategy for Future Research Activity

当初の実験計画では、C57BL/6系統ファウンダーマウスを得たのち、精細管内移植法が容易なヌードマウスとファウンダーマウス（F0）との交配を行い、3世代目に50％の確率でレシピエントとして使用できる免疫不全オスマウスが得られると計画していた。しかし、交配にかかる時間を要するため、ヌードマウス受精卵にインジェクションしてトランスジェニックヌードマウスを作製することとした。半年後には、レシピエントマウスを作製し、異種移植を開始できると考えている。また、ファウンダーマウスが得られなかった場合を考慮し、ヌードマウス由来精原幹細胞株を樹立し、発現プラスミドを遺伝子導入した後に精細管内移植法と自然交配によりトランスジェニックマウスを作製することを検討し、準備を進めている。

Causes of Carryover

トランスジェニックマウス作製の受託研究の開始が遅れ、作製費が未払いのため次年度使用額が生じた。