2020 Fiscal Year Research-status Report
Xist RNA dynamics in living cells
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20K06484
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
佐藤 優子 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (70435882)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | クロマチン / エピジェネティクス / ライブイメージング / 長鎖ノンコーディングRNA / X染色体不活性化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、不活性X染色体の構築過程に重要な役割を果たすXist長鎖ノンコーディングRNAについて、X染色体上への集積動態と不活性化遺伝子の発現抑制における役割を、生細胞観察により明らかにすることを目的とする。2020年度は、遺伝子発現抑制性のヒストン翻訳後修飾H3K27me3について、特異的抗体由来の生細胞プローブを作製して細胞周期に伴う不活性X染色体への集積動態を解析した。
H3K27me3特異的モノクローナル抗体産生細胞から、可変領域をコードする遺伝子領域をクローニングし、一本鎖可変領域を作製して蛍光タンパク質（sfGFP）融合型として細胞に発現させる蛍光プローブmintbodyを作製した。不活性X染色体を持つマウス胚性がん細胞MC12に核移行シグナル付加型H3K27me3-mintbodyを発現させ、細胞核内のH3K27me3集積動態を共焦点顕微鏡を用いてタイムラプス観察した。細胞周期マーカーとして、複製fociの構成因子であるProliferating cell nuclear antigen (PCNA)をmCherry融合型として共発現させた。
顕微鏡取得画像から、細胞ごとのH3K27me3集積部位の体積、形、蛍光輝度値の継時変化の解析を行った。PCNA-mCherryの細胞核内局在パターンから細胞周期のステージを判定し、10細胞分の解析データをまとめた。H3K27me3集積部位はDNA複製期が始まるとともに体積が増大し、修飾レベルは正弦曲線を描くことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
所属研究機関の出校制限により、生細胞観察などの予定していた実験ができなかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
進捗の遅れを取り戻し、モルフォリノプローブによるXist RNAの生細胞観察を行う。
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| Causes of Carryover |
所属研究機関の出校制限により予定していた実験ができなかったため、試薬や消耗品を発注しなかったため。進捗の遅れを取り戻して実験を行い、試薬や消耗品に使用する予定である。
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