2020 Fiscal Year Research-status Report
Identification of factors involved in the maintenance of circular chromosomes and applications for cancer therapy
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20K06488
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
上野 勝 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 准教授 (90293597)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | がん / 環状染色体 / 抗癌剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトの染色体は線状であるが、ある種のがんでは高い頻度で環状染色体が見つかる。環状染色体をもつがん細胞のみを選択的に死滅させることができれば、新しい作用機構を持つファーストインクラスの抗がん剤が開発できる。そこで本研究の目的は、ヒト環状染色体を維持する独自の細胞株を用いて、ヒト環状染色体の維持に関与する遺伝子や薬剤を発見し、発見した因子の作用機構を解析することで、環状染色体を持つ細胞に、どのような不都合が生じ、その不都合をどのような因子が克服しているのかを明らかにすることとする。上記の目的を達成するために、本研究では、主にヒト培養細胞を用いて、以下の３つを行う。(1) ヒト環状染色体を持つ細胞の生育を阻害する因子の探索。(2) (1)で発見した因子について、ヒト環状染色体の安定性に関係するかの検証。(3) (1)で発見した因子について、環状染色体を持つがん細胞の抗がん活性の検証。本年度は、（１）を行うためのアッセイ系の確立を目指した実験を行った。具体的には、環状染色体保有患者の血液中のB細胞をEBウイルスによって不死化した細胞からそのコントロール株として、遺伝学的背景は同じであるが、染色体が線状である株の単離を試みた。しかし、コントロール株の単離には至らなかった。また、人工環状染色体を持つ細胞株を用いて、環状染色体の安定性を失う頻度を評価できるアッセイ系の確立を試みた。しかし、人工環状染色体を不安定化させる可能性がある化合物を加えても、人工環状染色体を不安定化させたことを示す優位なデータが得られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々は、ヒト17番染色体が環状化した遺伝病患者由来の血液をEB ウイルスによる不死化した細胞をCoriell Instituteから入手し、解析を行ったところ、不死化した細胞において、環状化したヒト17番染色体が安定に維持されることを発見している。しかし、この細胞と同じ遺伝的背景で、しかも１７番染色体は２本とも線状のコントロール細胞は、入手できていない。Coriell Instituteから入手した、ヒト17番染色体が環状化した不死化細胞において、環状化したヒト17番染色体失った細胞が存在することから、この細胞を単離することで、上記のコントロール細胞となるのではないかと考えた。そこで、環状化したヒト17番染色体を持つ不死化細胞を1wellあたり１から６細胞くらいになるように薄めて、96wellプレートにまき、上記のコントロール細胞のクローニングを試みた。しかし、どのwellについても希釈前とほぼ同じ頻度の環状染色体を持った集団しか得ることができなかった。このことから、上記のコントロール細胞の入手は一旦保留にした。次にヒト細胞に人工環状染色体を導入した細胞株を用いて、この環状人工染色体を失う頻度を測定することで、環状染色体の安定性を評価することを試みた。人工環状染色体上には、ゲノムに発現している蛍光たんぱく質が特異的に結合する配列が組み込まれている。それにより蛍光画像上では光点として人工環状染色体を確認することが出来る。この細胞から候補化合物処理群とコントロール群を作成し、各群の人工環状染色体を保有する細胞の比率を比較するアッセイ系の確立を試みている。現段階では、人工環状染色体を不安定化させる可能性がある化合物を加えても、人工環状染色体を不安定化させたことを示す優位なデータが得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度は、上記で説明した人工環状染色体をもつ細胞株を用いて、人工環状染色体の安定性を評価するアッセイ系の確立を目指した。具体的には、先行研究で人工環状染色体を不安定化する可能性が考えられる化合物を加えたときに、人工環状染色体を失う頻度が上昇しなかった。この原因として、先行研究で人工環状染色体を不安定化する可能性が考えられる化合物が本当は人工環状染色体を不安定化しない可能性や、アッセイ系の誤差が大きい可能性が考えられた。そこで、本年度は、この問題の解決を試みる。さらに、確立したアッセイ系を用いて、人工環状染色体を失う頻度が上昇する化合物の探索を試みる。また、上記のヒト細胞を用いた実験と並行して、環状染色体をもつ分裂酵母を用いて、環状染色体の安定性に関与する薬剤や遺伝子の探索と解析も試みる。具体的には、トポイソメラーゼ阻害活性を持つと考えられる抗癌剤の類似化合物や、ヒトGsk3阻害剤などが、環状染色体をもつ分裂酵母の生育を阻害するかどうかの実験や、阻害する場合は、その標的因子の探索と解析を行う。さらに分裂酵母の実験で得られた結果が、ヒトの環状染色体の安定性にも保存されているかどうかを検証する。
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| Causes of Carryover |
昨年度は、環状染色体の安定性を評価するアッセイ系の確立に多くの時間を費やしたため、そのアッセイ系を用いたスクリーニングの実験に至らなかった。本年度はアッセイ系を確立させ、そのアッセイ系を用いてスクリーニングを行うため、昨年度使用しなかった費用を使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
