2021 Fiscal Year Research-status Report
tRNAレパートリー形成のためのtRNA遺伝子の発現制御機構の解明
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20K06490
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
吉久 徹 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (60212312)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | tRNA / 転写制御 / 転写因子 / tRNA検出因子 / tRNAレパートリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
独自に開発した新規tRNA定量法を用いた酵母のtRNAレパートリー解析により、発酵培地に対して呼吸培地では酵母の各tRNA種の発現量はそれぞれ増減するが、同じアミノ酸に対応するisoacceptor tRNA間ではほぼ全てでminor tRNAが増加する一方でmajor tRNAが減少し、tRNA量はisoacceptorレベルで制御される可能性が示された。この制御におけるtRNA遺伝子（tDNA）の転写の寄与を検討するため、tDNAプロモーター活性解析系の構築を行った。昨年度のtDNAプロモーター下でのsgRNA発現を用いたCRISPRiによるレポーターの転写抑制はある程度の結果を得たが、変異株取得にはより広いダイナミックレンジを持つ解析系が求められた。そこで、tDNA依存のshRNA発現を利用した酵母RNAi系の利用を検討したところ、tRNA発現量に応じた良好な発現抑制が得られ、現在、変異取得に向けた条件検討に入っている。また、これと並行してイントロン配列の異なるtDNAに着目して、pre-tRNA量のRT-qPCR解析を行った。tRNA-PheGAAをコードし、他のisodecoder遺伝子とは2塩基異なるイントロン配列を持つtF(GAA)D遺伝子の転写活性をそのpre-tRNA量で推定したところ、これ以外のtRNA-PheGAA遺伝子座の転写活性の平均より明らかに低いこと、また、この遺伝子座以外のtRNA-PheGAA遺伝子の転写は発酵培地に比べ呼吸培地で1/2程度まで下がるのに対して、tF(GAA)D遺伝子はほとんど転写活性が変わらないことなどが判った。即ち、同じisoacceptor tRNAをコードしていても個別のtDNAの間で、転写の状態に個性がある場合があることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究実績の概要に示したとおり、2021年度にはtDNAのプロモーター活性を簡便に分析する方法が確立したが、昨年度から懸案となっていた遺伝学的なtRNA発現制御因子探索に向けて解析がようやく始められる状態となったところで、変異株所得には遅れが生じている。他方、個別のtRNA遺伝子についての発現状態をpre-tRNA量から推定する方法が利用可能になったことは、上記の解析をイントロンを含むtDNAに対して適用した場合、tDNAの転写状態を独立した解析に寄って検討するための良い系が得られたことになる。なお、2021年度に計画されていたtRNA検出系としてのアミノアシルtRNA合成酵素に関する研究計画については、予定通りの進捗に至っていない点も、2022年度に向け、改善を要する点である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度は持ち越された計画を含めた内容について、以下の2項目に分けて解析を進める。
［A］tDNA特異的な転写因子の探索として、特定のisoacceptorに対するtDNAの発現制御が異常となる変異株の単離を加速する。また、単離された変異の原因遺伝子の同定から、tDNAプロモーターの制御に関わる因子群を明らかにし、特に同定された因子のtDNAとの結合や、RNA polymerase IIIやTFIII基本転写因子群との相互作用に着目して、その機能を解析する。
［B］tRNAの量的制御に関わるセンサー分子探索の1つとして、既知のtRNA種特異的なtRNA結合因子でかつ核内に存在し、進化的にも保存されている分子と、tRNAの核-細胞質間輸送に着目して研究を進める。アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）は同じアミノ酸をチャージするtRNA群を他と識別でき、真核生物ではその一部が核に存在する。そこで、TyrRSやValRS等のARSについて、核局在に必要なNLSを欠失した変異株を構築し、その変異株における各tRNA量の変化を検討する。次に、tRNAの核-細胞質間ダイナミクスのtRNAの発現制御への影響を検討する。もし細胞が成熟体tRNA量を核内で検知するならば、tRNAの核内輸送は対象分子を核に運ぶために必須となる。tRNAの核-細胞質間分布に影響を与える輸送因子Los1やMtr10などの変異を用いて、tDNAの転写状況がどう変わるか検討する。
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