2020 Fiscal Year Research-status Report
Study on mechanisms for maintenance of mitochondrial DNA integrity
| Project/Area Number |
20K06498
|
|---|
| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
凌 楓 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (70281665)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | ミトコンドリア / 酸化ストレス / ミトコンドリアDNA / 二本鎖切断 / ミトコンドリアDNAの組換え / 除去修復 / フリードライヒ運動失調症 / ミトコンドリアのABCトランスポーター |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
Ntg1が出芽酵母のミトコンドリアDNA(mtDNA)の複製原点(ori5)に二本鎖切断を導入することで組換え依存型mtDNAのローリングサークル型を開始する。mtDNA)の複製原点(ori5)を持つ、短くなったmtDNA断片(HS rho minus)が野生型mtDNAに対して複製の優勢を持つことが知られている。ところが、Ntg1遺伝子を破壊すると、この優勢複製が低減する。脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ(Apn1)がこのようなmtDNA断片の優勢複製に対して影響するかどうかについて不明でした。本年度においてHS rho minus mtDNA断片を持つ細胞のapn１破壊株を構築した。接合型の異なるapn１破壊株の二倍体細胞ではmtDNA断片の優勢複製がなくなることを見出した。このことから、Apn1もHS rho minus mtDNAの優勢複製に関与することが示唆された。野生型の出芽酵母を親株として、apn1 破壊変異株を構築し、グルコース培地で培養し、約20世代増殖後、プチートコロニーの発生率が僅か数%増加したことを確認した。ヒトATM1はフリードライヒ運動失調症の原因遺伝子である。出芽酵母atm1-1変異株はグルコース培地で培養すると、約２０世代増殖後、90%以上の子孫細胞がmtDNAの欠失変異によって呼吸機能を喪失し、プチートコロニーとなることも確認した。しかし、atm1-1とapn1破壊変異の二重変異株を構築すると プチートコロニーの生成率が60％となった。atm1-1とapn1の二重破壊変異株においてMhr1を発現させるとプチートコロニーの生成率が5%以下に抑えられた。これらの結果から、atm1-1変異株においてmtDNAの欠失変異による呼吸機能喪失をApn1の活性阻害とMhr1の大量発現によるmtDNAの組換え能増強で抑えられることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
atm1-1変異株はATM1遺伝子の変異によるものである。ヒトATM1はフリードライヒ運動失調症の原因遺伝子でミトコンドリアのABCトランスポーターをコードしている。atm1-1変異株はグルコース培地においてmtDNAの欠失変異によって大量のプチートコロニーを作り出す。脱プリン脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ(Apn1)がDNA修復酵素として知られている。出芽酵母のAPN1遺伝子を破壊するとatm1-1変異細胞においてチートコロニーの発生率がを抑えることができたことは期待通りの結果である。組換え酵素Mhr1の過剰発現でatm1-1変異細胞においてチートコロニーの発生がほぼ完全に抑えられた。ヒト細胞において同じことが起きれば希少難病であるフリードライヒ運動失調症の対策に貢献できると確信しています。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後、野生株、mhr1-1 変異株及びmtDNAが完全に欠失した酵母株を、グルコースを炭素源とする培地で30度で静置培養した時の生存率の変化を比較すると、mhr1-1 変異株は野生株と比べて生存率が低下傾向にあり、生存率は顕著に低下した。これらの結果から、欠失変異mtDNAによるヘテロプラスミーを引き起こすmhr1-1 変異が、ヘテロプラスミーと経時寿命との相関性を検討する鍵となると考えた。mhr1-1 変異株は、グリセロールを炭素源とする培地で温度感受性を示す。そこで、26 度、30 度、34 度、37 度の各温度で培養したmhr1-1 変異株における欠失変異mtDNAの生成と生存率の変化を測定することで、欠失変異mtDNAによるヘテロプラスミーのレベルと経時寿命との相関関係を明らかにする。さらにapn1破壊変異とmhr1-1 変異との二重変異株の経時寿命に対する影響を調べることで、除去修復に伴うmtDNAの二本鎖切断に起因する欠失変異と経時寿命との相関関係と、Mhr1を介したmtDNA完全性維持の生理学的意義を明らかにする。
|
| Causes of Carryover |
まだ、C1 platesの購入をしていないためである。
|
