2020 Fiscal Year Research-status Report
シアノバクテリアにおける鉄欠乏誘導性蛋白質の構造基盤解明
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20K06502
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
河合 寿子 (久保田寿子) 山形大学, 理学部, 助教 (10599228)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | チラコイド膜 / 光化学系I |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シアノバクテリアの光化学系I(PSI)は、PSI分子内に含まれるクロロフィルやフィコビリソームにて集光を行う。しかし細胞が鉄欠乏状態にさらされると、鉄ストレス誘導性クロロフィル結合タンパク質であるIsiA(iron stress induced gene A)を合成して集光を助けるという仕組みを持っている。本研究で注目している窒素固定シアノバクテリアAnabaenaのPSIは四量体を形成するという特徴を持っているため、IsiAが結合すると、光合成生物の中でも特に大きなクロロフィルネットワークからなる集光システムが構築されると予想される。本研究では、Anabaenaのチラコイド膜に埋め込まれたPSIの周囲にどのようにIsiAが配置されているかについて高速AFMを用いて解明することを目指している。
研究当初はチラコイド膜がマイカに張り付かないという問題点があった。そこで、純度の高いチラコイド膜を得るために、ショ糖密度勾配遠心法にて膜に弱い力で結合しているタンパク質を取り除くステップを追加した。その結果、フィコビリソーム由来の青い画分が分離され、二本の緑のバンドとして純度の高いチラコイド膜を得ることができた。また、細胞破砕方法を三通り検討し、観察に適した薄い膜を貼ることができる条件を見いだした。そのチラコイド膜を用いてAFM観察を行った結果、高さ 2.0-3.0 nm、直径 25-30 nmの粒子および、高さ 約4 nm、直径 20~30 nmの粒子が埋め込まれている様子を捉えることに成功した。これらはそれぞれ、細胞質側からみたPSI四量体、ルーメン側から見たPSIIである可能性が示唆された。今後は精製条件や測定条件の最適化を行い、分解能向上を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究開始当時は、Anabaenaのチラコイド膜がマイカに張り付かないという問題点があった。この問題を解決するために、まずは測定バッファーの種類や塩濃度、また吸着時間などを検討したが改善しなかった。そこでマイカの表面をよく観察すると、可溶性のタンパク質粒子で覆われていることがわかった。これは、可溶性の集光色素フィコビリソーム由来であると推定できた。そこで細胞破砕後に2000gで未破砕細胞を除いた後、さらにショ糖密度勾配遠心法にて膜に弱い力で結合しているタンパク質を取り除くステップを追加した。その結果、フィコビリソーム由来の青い画分が分離され、二本の緑のバンドとして純度の高いチラコイド膜を得ることができた。そのサンプルを用いて再度マイカへの吸着を試みた結果、チラコイド膜をマイカ上に貼り付けることに成功した。さらに、細胞破砕方法についてはガラスビーズ破砕、リゾチウム処理後の浸透圧破砕、ソニケーション破砕を検討した。その結果、ソニケーション破砕サンプルの場合に最もリポソームの吸着が少なく観察に適していることが見いだされた。また、ショ糖密度勾配遠心法で分離したチラコイド膜は二本のバンドとして分離されるが、密度が低いサンプルはリポソームも多く張り付いた。もう一方のサンプルでは高さ15 ~25nm程度の薄い膜を広範囲に貼ることができた。この膜を用いてAFM観察を行った結果、高さ 2.0-3.0 nm、直径 25-30 nmの粒子および、高さ 約4 nm、直径 20~30 nmの粒子が観察された。これらはそれぞれ、細胞質側からみたPSI四量体、ルーメン側から見たPSIIである可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までに、PSI四量体及び、PSII二量体と考えられるタンパク質粒子を捉えることができている。しかしながら分解能が足りず、確実な同定ができていない。またIsiAはチラコイド膜から突出している領域の高さが非常に低いためPSIと考えられる粒子の周囲にIsiAリングは確認できていない。今後は分解能向上を試み、PSI四量体の周囲にどのように鉄欠乏時特異的集光アンテナIsiAが配置されているかを解明する。分解能向上のための具体的なアプローチとして、細胞破砕時のバッファーのpHや塩の種類、濃度を検討する予定である。また、これまでの分析に使用してきた670 nmのレーザーではクロロフィルが励起されPSIやIsiAがダメージを受けると考えられる。そこで、今後はクロロフィルを励起させない980nmの半導体レーザーを用いてカンチレバーの振幅変調を計測する。
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