2020 Fiscal Year Research-status Report
環境に対応して機能を変えるホモ多量体酵素の動的構造変化の解析
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20K06509
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
池上 貴久 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (20283939)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 四次構造 / Moon-lighting蛋白質 / GAPDH / 神経変性疾患 / ホモ多量体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酵素蛋白質の半数近くはホモ多量体であり、それらの中には、環境に応じてサブユニット数を変え、それにより全体構造を変えることで複数の異なる機能を発揮する酵素もあるのではないかと考えている。そのような例として、解糖系に必須のグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（GAPDH）に着目した。実際に GAPDH は神経変性疾患に関わる蛋白質をはじめ数十種類もの蛋白質や核酸と特異的に相互作用し、解糖系とは異なる多くの機能も持つことが知られている（moon-lighting 蛋白質）。しかし、このように多様な機能を発現できる物理的な仕組みは不明である。
筆者はこれまで好熱性バチルス菌由来の GAPDH を中心に解析してきたが、これは NAD 結合における負の協同性を調べるためであった。そこで、その解析技術を活かしつつ human 由来の GAPDH も調製することとした。遺伝子を合成し His-tag 有無の２種類のプラスミドを作成した。両者ともに大腸菌で多量に発現した。His-tag 有りの場合、発現蛋白質の多くが inclusion-body となってしまったが、精製を工夫することにより NMR 解析に足る量を調製することができた。
その発現系と精製法を確立した後、実際に 2H, 15N 均一標識、Met, Ile, Leu, Val のメチル基13C/1H 特異的標識を試みた。この試料に NMR のメチル TROSY 法を適用した結果、150 kDa という高分子量でありながら、非常に高分解能のスペクトルを得ることができた。現在、Met メチル基 10 個の帰属が完成し、Ile の帰属を続けている。これにより、GAPDH の化学修飾などによる構造変化と機能変化との相関を動的に解析できる。詳細は「現在までの進捗状況」に記す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「研究実績の概要」に記すように、human 由来の GAPDH の遺伝子を含むプラスミドを調製した。N 末端に His-tag が有る場合と無い場合の両方のコンストラクションを作成した。それぞれの発現系と精製法を確立した後、実際に 2H, 15N 均一標識、Met, Ile, Leu, Val のメチル基 1H/13C 特異的標識を試みた。これらの調製に必要な、重水を含む安定同位体標識試薬は非常に高価であるので、個々の必要量をどの程度減らせるかを検討した。
その結果、重水 100 mL の大腸菌培養により、オーバーナイトの NMR (methyl-TROSY) 測定で解析に足るスペクトルを得られることが分かった。この量の検討は非常に重要である。なぜならば、個々のメチル基の帰属は、まだ現在のところ、それぞれのアミノ酸の変異体の比較解析に頼っている。そのため、帰属のために何十種類もの変異体の発現、精製、測定、解析を続ける必要があり、通例のように 1~2 L ずつの培養は予算的に不可能である。上記の検討を続けた結果、Met 10 個すべて、および Ile のうち 5 個を帰属することができた。
さらに、活性炭に吸着する蛋白質のロスをできるだけ減らすための条件を検討し、NAD なしの apo 体の NMR スペクトルを得ることに成功した。apo 体は不安定で結晶構造解析も不可能と思われていたが、筆者らは精製過程での取り扱いを工夫し酸化を防ぐことにより高分解能での NMR スペクトルを測定することができた。その結果、これまでに考えられていたこととは異なり、apo 体は holo 体と同じようなホモ四量体構造を維持していることを示唆する結果を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
Met のメチル基は 10 個ともすべて帰属できた。しかし、Ile は 22 個のうち 5 個の帰属にとどまっている。この帰属の量は、GAPDH の動的構造変化の解析における分解能そのものとなる。そこで、Ile での 8 割の帰属を目指す。同時に、酸化剤/還元剤を入れた状態、apo/holo 型、各種 Met, Cys 変異体の NMR スペクトルを比較することにより、構造変化を起こす引き金となっている event が何であるかを同定する。当初は NAD が全て外れ apo 体となることが二量体や単量体への分裂を引き起こすのではないかと思われていたが、筆者はそうではないことを示唆する結果を得ている。
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| Causes of Carryover |
感染防止のため実験室がほぼ閉鎖となり、それは今でもオンライン授業などの形で少し続いている。これによりいわゆるウェットラボ実験は停止・そのあと縮小せざるを得なかった。その代わり、NMR のメチル TROSY 測定のパルスプログラムについて、サブユニット濃度が 1 μM 未満でもピークを観測できるように改良することに力を注いだ。実際にその効果は劇的で、重水 100 mL の培養で 8 割程度の発現蛋白質が inclusion body に行ってしまう状況の中、150 kDa、摂氏５度という悪い測定条件のもと、オーバーナイトで十分にスペクトルを観測できるほどになった。
2021 年度は計画どおりの 15N, 2H, 13C 安定同位体を使って、メチル基の帰属、および、動的構造の解析をおこなう予定である。
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