2021 Fiscal Year Research-status Report
環境に対応して機能を変えるホモ多量体酵素の動的構造変化の解析
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20K06509
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
池上 貴久 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (20283939)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 四次構造 / Moon-lighting 蛋白質 / GAPDH / 神経変性疾患 / ホモ多量体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
代謝酵素の中には、通常はその本業を触媒しているが、あるきっかけにより別の機能を獲得するようなものがある。このような酵素は moon-lighting（副業）蛋白質と呼ばれており、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（GAPDH）が、その一例としてよく知られている。
細胞が老化してくると、活性酸素種が増え、それらが活性部位のシステイン残基を修飾する。また、老化により NAD が減少するので、補酵素である NAD が解離しはじめ、apo 体になる。これがきっかけとなって GAPDH は別の分子（蛋白質 Siah1 や mRNA など）と相互作用して別機能を獲得するようになると予想されている。しかし、その際の構造的な知見は全く得られていない。複合体の構造が一つもないことを考えると、相互作用は動的、遷移的であることが予想される。そのような特徴の相互作用を検出するため、筆者は NMR を使っている。
この GAPDH の NMR 信号を帰属するために、2H, 15N, メチル基 13C/1H 特異的標識を行い、NMR のメチル TROSY 法を適用した結果、150 kDa という高分子量でありながら、非常に高分解能のスペクトルを得ることができた。そして各残基を変異することにより 10 個の Met および、17 個の Ile を帰属した。さらに、apo 状態の GAPDH に NAD, ATP, 酸化剤（H2O2, NOR3）, 還元型グルタチオンを加え、NMR 信号の変化を見た。さらに thermal shift assay, 分析ゲル濾過 , mass-photometry を使って構造を解析した。その結果、apo 状態、低濃度 < 1 μM, 低温 4 度において、サブユニットが解離していることを示唆する結果が得られた。さらに ATP を加えると、これが促進された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
一昨年度は human 由来の GAPDH 遺伝子を含むプラスミドを作成した。これには N 末端に (His)6 タグが付いている。以前はタグが付いていなかったが、impurity のプロテアーゼで切断されるという現象が起きたため、精製度を上げる目的でタグを接続した。その結果、プロテアーゼによる非特異的切断を防ぐことができた。しかし、代わりに大腸菌において発現蛋白質が inclusion-body に半分ほど移ってしまった。これは 15 度の低温で培養することにより、いくらか緩和することができた。
昨年度は、2H, 15N, Met, Ile, Leu, Val のメチル基 1H/13C 特異的標識を行い、Met と Ile を一つずつ変異することによって、これらの帰属を試みた。10 個の Met については順調に帰属が進んだ。しかし、Ile においては、１アミノ酸を置換しても数個のピークが同時に動いてしまい、確定的な帰属は半分ほどに終わった。今後は、Ile から Val だけでなく別の残基に変異することも検討する（今後の研究の推進方策に記述）。この 2H, メチル基 1H/13C 標識試料の NMR (methyl-TROSY) 測定は非常にうまく進み、サブユニット濃度 4 μM, 4 度でも測定ができた。
一昨年は、活性炭を使って apo 体を慎重に調製すると、それは holo 体と同じようなホモ四量体構造を維持していることを示した。これは新たな知見となる。昨年度は、それに NAD, ATP, 酸化剤（NOR3, H2O2）, 還元型グルタチオンを加えて NMR ピークの変化を見た。その結果、ATP 存在下で GAPDH 四量体は二量体や単量体に分裂していることを示唆する結果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
GAPDH は高分子量であるため、通常の主鎖アミド 1H/15N 基を利用した帰属法はほぼ不可能である。そこで、2H, 15N, Met, Ile, Leu, Val メチル基 1H/13C 標識試料を調製し、メチル基を含む残基を一つずつ別残基に置換しながら帰属を行った。上記のように Met については問題なく帰属が進んだ。しかし、Ile においては１アミノ酸を変異しても数個のピークが同時に動いてしまい、確定的な帰属は半分ほどに終わった。今後は、Ile から Val だけでなく別の残基に変異することも検討する。分析ゲル濾過、および mass-photometry （阪大蛋白研のご協力）を使い、さまざまな条件下（apo 状態, +NAD, +ATP, +NOR3）での分子量を調べた結果、< 1 μM, 4 度という条件がサブユニット開裂などに必要であることが分かってきた。この条件は NMR ではかなり厳しい。しかし、サブユニット開裂が起きると、おそらくサブユニット界面がフレキシブルになることから、それらの残基からのピークは NMR で観ることができる。今後は、それらのピークが本当にサブユニット界面由来であるかの調査が必要である。そのためには、メチル基の帰属を進める、界面にある Leu, Val, 芳香環残基の置換変異体の解析、人工的二量体の調製が有効であると考えている。その二量体変異体はほぼ完成したが、impurity のプロテアーゼにより C 末端から 30 残基目ぐらいの箇所が切断されている可能性が考えられた。今後はこの切断箇所を変異させるなどの工夫が必要である。
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| Causes of Carryover |
高価な安定同位体試薬（15N, 13C, 2H 標識アミノ酸, 重水）や精製器具（カラム類）を発注したが、それらは輸入品であるため、半年経っても納入がなされなかった。そのため、次年度の納入に切り替えた。実験については、既存の古い器具などで代用した。新品が届いた時点で、再実験をする必要がある。今年度はコロナ禍に加えて世界の不安定事情により、安定同位体試薬の輸入が難しくなっている。さらに単価も急に上がった。そこで、予算内で研究できるように工夫していく必要がある。
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[Journal Article] Sensitivity enhancement by sequential data acquisition for 13C-direct detection NMR.2021
Author(s)
Furuita, K., Sugiki, T., Takamuku, M., Hattori, Y., So, M., Kawata, Y., Ikegami, T., Fujiwara, T., Kojima, C.
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Journal Title
J. Magn. Reson.
Volume: 322
Pages: 106878
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Crystal structure of higher plant heme oxygenase-1 and its mechanism of interaction with ferredoxin.2021
Author(s)
Tohda, R., Tanaka, H., Mutoh, R., Zhang, X., Lee, Y.H., Konuma, T., Ikegami, T., Migita, C.T., Kurisu, G.
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 296
Pages: 100217
DOI
Peer Reviewed
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