コンドロイチン硫酸による免疫応答制御：糖鎖構造とシグナル伝達機構

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06513
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: 幡野 その子 愛知医科大学, 分子医科学研究所, 助教 (40434625)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: コンドロイチン硫酸 / 抗原提示細胞 / 免疫

Outline of Annual Research Achievements

生体防御機構は、自然免疫と獲得免疫の複合的な免疫応答が担っている。自然免疫は局所で即時に反応し、病原体や腫瘍細胞などの増殖に対する初期防御として機能しているが、最終的な病原体などの排除と免疫学的記憶の形成には獲得免疫が必要である。自然免疫の活性化による獲得免疫の誘導には、マクロファージ や樹状細胞などの抗原提示細胞が中心的な役割を担っている。
近年、抗原提示細胞の機能制御にコンドロイチン硫酸が関わっていることがわかってきた。CSはグルクロン酸とN-アセチルガラクトサミンの二糖単位が数十回繰り返し連なった直鎖上の糖鎖で、硫酸基の修飾を受けて多様な構造をとり、コアタンパク質と共有結合しプロテオグリカンとして存在する。コンドロイチン硫酸の微細構造が同分子の機能の特異性を規定していることが次々と報告されているが、生体反応に対する機能は一定した見解は得られていない。それは生体内の糖鎖が多様性に富むため、天然由来コンドロイチン硫酸を用いた研究からは確立された見解を得るのは難しいことによる。申請者の研究室では、糖鎖長と硫酸基修飾部位の規定されたコンドロイチン硫酸を酵素化学的に合成する技術を有している。本研究ではこの技術を用いて、糖鎖長と硫酸基修飾部位の規定されたコンドロイチン硫酸を酵素化学的に合成して実験に用いる。実験では抗原提示細胞をコンドロイチン硫酸存在下で培養し、エンドトキシン などの刺激物質を用いて活性化を試みる。この際、抗原提示細胞の活性化を制御するコンドロイチン硫酸の微細構造と制御機構を明らかにする。以上により免疫機構の制御できるコンドロイチン硫酸の構造を明らかにすることで、その有効利用に貢献することを目指す。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コンドロイチン硫酸は糖鎖の基本単位となる二糖に結合した硫酸基の結合位置と数によってA,B,C,D,E,H,Kの7種類に分類されている。哺乳類の組織において産生されるコンドロイチン硫酸は二糖構造に硫酸基が1箇所結合したAやCが主成分であるが、硫酸基が2箇所結合するDやEは少ない。特にコンドロイチン硫酸Eは脳で有意に存在していることがわかり、その機能性が注目されている。高硫酸化されたコンドロイチン硫酸は生理活性物質との相互作用が強くなることによりその機能性が発揮されると考えられているが、免疫反応に対するコンドロイチン硫酸Eの作用は知見はあまり報告されていない。そこで私達はコンドロイチン硫酸Eが樹状細胞の活性化にどのように機能するかを検証する。前述したようにコンドロイチン硫酸は硫酸基の結合位置と数によって分類されているが、同じコンドロイチン硫酸Eにおいてもその糖鎖長やE構造の割合によって機能が変化する。天然由来コンドロイチン硫酸Eには様々な糖鎖長とE構造の割合があり、分子構造によって機能が違うとされている。そこでコンドロイチン硫酸Eの酵素化学的合成に先立って、各種構造による作用を確認するためスルメイカ軟骨から様々な構造のコンドロイチン硫酸Eを抽出を試みた。この抽出と糖鎖末端修飾に時間がかかってしまったのが進捗状況がやや遅れている理由である。

Strategy for Future Research Activity

マウス骨髄由来多能性幹細胞を採取し分化させた未熟樹状細胞をスルメイカより採取した各種コンドロイチン硫酸Eをコーティングしたプレート上で一晩培養する。その後エンドトキシンのひとつであるリポポリサッカライドを添加することによって樹状細胞を活性化し、成熟した樹状細胞が産生するサイトカインやケモカインなどの生理活性物質の量をコントロールと比較する。コントロールはコンドロイチン硫酸Eをコーティングしていないプレート上で培養した樹状細胞にリポポリサッカライドを添加したものである。樹状細胞が産生する生理活性物質は定量的リアルタイムPCRにてmRNAレベルで、ELISA法にてタンパク質レベルでの発現量を測定する。また、樹状細胞は抗原提示のためリンパ節へ遊走するのが特徴的であることから、コンドロイチン硫酸Eコーティングプレート上で活性化した樹状細胞の遊走能をボイデンチャンバー等を用いて測定する。
以上より天然由来コンドロイチン硫酸Eを用いた実験から得られた結果を検討し、どのような構造のコンドロイチン硫酸Eがどのように樹状細胞に作用するのかを明らかにする。その上で人工コンドロイチン硫酸Eを酵素化学的に合成し、より顕著な作用が出る構造を精査する。
天然由来コンドロイチン硫酸Eで良好な結果が得られない場合はコンドロイチン硫酸分解酵素を用いたり、コンドロイチン硫酸合成酵素を欠失したマウス由来の骨髄を用いることによって、一旦コンドロイチン硫酸のない状態を作り出し、そこへコンドロイチン硫酸Eを投与することにより作用を検討する。

Causes of Carryover

当該年度は研究の準備段階である材料の調整を主に行なってきた。原料のイカ軟骨は安く入手することができ、そこからのコンドロイチン硫酸抽出には当該研究室が既に有している試薬類を使用したため、物品費はあまり掛からなかった。
また、新型コロナ感染症の流行により学会やセミナーなどがオンライン開催となったため旅費を使用することがなかった。このような状況であったため次年度使用額が生じた。
今後の使用計画では以下のような高額な試薬類を購入する予定である。抗原提示細胞へ分化誘導するためのサイトカインなどの生理活性物質、抗原提示細胞が分泌するタンパク質を検出するためのELISAキット、またRNAレベルでの発現を検出するための関連試薬などがある。