2020 Fiscal Year Research-status Report
ATP 合成酵素のプロトン駆動力から回転エネルギーへの変換機構の解明
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20K06514
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岸川 淳一 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (80599241)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 回転分子モーター / V-ATPase / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / 膜タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析により、ATP 合成酵素のプロトン駆動力による回転力発生機構を明らかにすることである。ATP 合成酵素は、膜内外に形成されたプロトン駆動力を回転エネルギーに変換し、そのエネルギーを利用することで ATP を合成する。ATP 合成の最初のステップであるプロトン駆動力から回転エネルギーへの変換は、ATP 合成酵素の膜内在性ドメインが担う。しかし、構造情報の不足から、その複雑で巧妙な変換機構には未だに不明な点が多い。また、報告されている膜内在性ドメインのほとんどすべての構造は、阻害状態の構造であり、プロトンを輸送している途中の構造、いわゆる活性状態の構造の報告はない。本研究では、好熱菌 Thermus thermophilus 由来のV型 ATP 合成酵素の膜内在性ドメイン（TthVo）の活性状態での構造を明らかにすることで、膜内在性ドメインでどのようにプロトン駆動力が回転に変換されるかを明らかにする。本研究の前身研究である TthVo の構造を 3.9 オングストローム分解能で報告した（Kishikawa et al, 2020, eLife）。単離した TthVo が自己阻害型になっており、得られた構造から自己阻害型の機構を明らかにした。また、阻害型から復帰する機構を示唆することができた。
今後、さらなる高分解能構造を目指すために、クライオ電顕の観察用基板の調製を行った。観察用基板の評価を行い、クライオ電顕画像の大量撮影後、解析を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、好熱菌由来の V 型 ATP 合成酵素の膜内在性ドメイン（TthVo）の活性型の構造を、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析によって明らかにすることを目的とする。単粒子解析を行うためには、サンプルを高純度で精製する必要があるが、精製条件は確立している。また、サンプルの単分散性も重要であるが、十分に単分散性が高いことも確認している。比較的高分解能で TthVo の構造を報告できたことからも、TthVo は単粒子解析に適したサンプルであることがわかる。精製したTthVo を用いて、クライオ電顕の観察用基板の調製も重要なポイントであるが、いくつかの条件で基板を調製し、クライオ電顕の撮影画像上で TthVo に対応する単粒子画像が確認できている。
また、これまでクライオ電顕での撮影は、電顕管理施設の支援を受けてきたが、２０２０年４月に大阪大学蛋白質研究所に異動したことで、実際に自身でクライオ電顕を操作して、電顕画像の撮影を行える環境になった。そのためのトレーニングを行い、現在クライオ電顕の操作・撮影の一連の作業を自身で行うことができるようになった。
新型コロナの影響により、4月下旬から5月末まで学内への入構禁止措置がなされた。また、研究室新設に伴う研究室の引っ越し、研究環境の構築などが重なり、前期（4月～10月）の多くは実際の研究活動が制限されていたため、"進捗がやや遅れている"とした。現在は、研究環境が整ったので、精力的に研究を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
すでに、クライオ電顕での撮影のための観察用基板は準備できているので、その基板を用い、1000枚程度の撮影を行い、基板の評価を行う。十分に単粒子が存在し、高分解能解析を望めるような基板であれば、その基板を使って、大量撮影（～10,000 枚程度）の撮影を行い、解析を進める。観察用基板の品質が十分でない場合には、再度基板の調製を行う。サンプルの濃度や体積、ブロット時間の調製、また基板の材質等の検討を行い、大量撮影に最適な基板を調整する。
撮影画像を用いた解析には、単粒子解析に最もよく用いられているRELION のほか、Cryosparc での解析を行う。近年、深層学習の単粒子解析への応用が盛んに行われている。代表的なものとして、粒子の検出を行う Topaz や Cryolo、3次元構造の異方性を評価する cryodrgn、密度マップの部分増強を行う deepEMhancer がある。本研究で試みるTthVo の構造分類は、大きな構造の違いというよりは、僅かな違いである可能性が高いため、これらの手法を積極的に取り入れ、高分解能で構造を明らかにしていく。
まず、初期構造としてできるだけ高分解能の TthVo の構造解析を目指す。プロトンの輸送などを議論するためには、水分子やそれを配位する残基が重要である。そのために、これらの分子が可視化できる程度の分解能（< 2.5 オングストローム）が望ましい。水分子を可視化するために必要な分解能が得られない場合は、シミュレーションによる水分子の配置も検討する。
初期の高分解能構造が得られた場合には、その構造や単粒子画像を元に、詳細な分類を行い、複数の状態での構造獲得を目指す。得られた複数構造から、プロトン輸送機能およびプロトン駆動力を回転エネルギーに変換する機構について議論する。
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| Causes of Carryover |
自身の異動により、予算として計上していたクライオ電顕使用料と移動費が必要なくなった（35万円）。また、異動先の研究室では、画像解析を行う解析PC環境が整っているため、計上していたGPU購入の必要が無くなったため（30万円）、次年度使用額が生じた。
生じたものは、別途必要となるクライオ電顕作業用の備品（精密ピンセット 10～15万円程度 x 2本）や小型インキュベーター（20万円）の購入に予算を充てる予定である。
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Research Products
(2 results)
