2021 Fiscal Year Research-status Report
種によって異なる低複雑性配列から液-液相分離の分子機構を読み解く
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20K06525
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
大橋 祐美子 神戸大学, 理学研究科, 特別研究員(RPD) (10422669)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 液-液相分離 / 低複雑性配列 / 天然変性蛋白質 / Sup35 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内には、液-液相分離によって形成される液滴が無数に存在し、特定の生体分子が局所的に濃縮されている。液滴には多様な機能がある事が知られており、その制御メカニズムの解明は、今後の創薬に新たな展開をもたらす事が期待できる。しかし液滴形成の詳細な分子機構は未解明である。本研究は、4種の酵母Saccharomyces cerevisiae(SC)、Kluyveromyces lactis(KL)、Candida albicans(CA)、Schizosaccharomyces pombe(SP) 由来の翻訳終止因子Sup35のN末端天然変性領域(Sup35NM)を用い、そのアミノ酸配列と液滴形成特性から、液-液相分離のメカニズムの解明を目指すものである。
1年目の研究で、出芽酵母SC由来Sup35NMの液-液相分離は、温度感受性が高い事が示され、その温度感受性にはSC-Sup35NMのNドメインの局所構造が重要である事が示された。２年目は同様の実験をSC以外の３種(KL, CA, SP)について行った。SCと同じ出芽酵母由来のKL-Sup35NM, CA-Sup35NMの液-液相分離はSCと同様に高い温度感受性を持っていたが、KLは液滴形成温度が低温側へのシフトしていた。この温度の変化がNドメインの性質からもたらされるのかを確認するため、Nドメインのみの蛋白質を作成中である。また、KL/CA-Sup35NMは形成した液滴からのアミロイド形成が速やかに起こる事が判明した。
さらに、分裂酵母由来のSP-Sup35NMは温度感受性及び環境感受性が極めて低く、広範囲の溶媒条件で液滴を形成した状態である事が分かった。Sup35は翻訳終止に必須の蛋白質であり、細胞内で常に液滴状態である事は考えにくく、他の生体分子の力を借りて環境感受性を獲得している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請当初より予定していたSC-Sup35NM、KL-Sup35NM、CA-Sup35NMの液-液相分離の特性について多くの事が分かってきた。また２年目から、当初の計画には無かった異種酵母由来のSP-Sup35NMを導入した。４種目の導入により、全く異なる液-液相分離特性を持った種を入手することができ、本研究は順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究でSC-Sup35NM、KL-Sup35NM、CA-Sup35NM、SP-Sup35NMの液-液相分離特性が明らかになったので、その特性がNドメイン、Mドメインどちらに由来するのかを調べるため、先ずそれぞれのNドメインのみのリコンビナント蛋白質を作成し、その相分離特性を比較する。SC-Sup35NMではＮドメインの局所構造が相分離特性を決定している事が明らかになってきており、それぞれのＮドメインの局所構造の有無、そしてどの程度コンパクトになっているかを調べる予定である。
また、液-液相分離に取り込まれるためには、どの程度配列の類似が要求されるのかを、これら異種酵母由来のSup35NMを用いて調べたい。それぞれの蛋白質に蛍光ラベルを入れ、蛍光顕微鏡で液滴の融合が起きるのかを調べる。その液滴内からアミロイド線維の形成が始まるのを合わせて観察する予定である。
さらに、SP-Sup35NMの結果から、細胞内の他の分子が液-液相分離特性に関与している可能性が示唆され、それについても調べていきたいと考えている。これらの蛋白質に蛍光蛋白質を繋げたものを酵母細胞内で発現させ、先ずはその挙動を比較する。Sup35NMの液-液相分離は、酵母を炭素源枯渇状態におく事で誘導され、炭素源の添加で解離することが報告されている。試験管内では環境応答性の低かったSP-Sup35NMが、その他のSup35NMと比較し、細胞内でどのようにふるまうのかを調べる。
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| Causes of Carryover |
感染症の蔓延のため、学会やその他の会議等がすべてオンライン形式となり、旅費の支出が無くなった事が理由である。
次年度使用額は、当初の計画には入っていなかった、新規の蛋白質SP-Sup35NMの作成や実験の費用として支出する。
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