2020 Fiscal Year Research-status Report
非凍結結晶を用いた“in crystallo”酵素反応解析
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20K06530
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
村川 武志 大阪医科大学, 医学部, 助教 (90445990)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 秀行 大阪医科大学, 医学部, 教授 (00183913)
馬場 清喜 公益財団法人高輝度光科学研究センター, タンパク質結晶解析推進室, 主幹研究員 (00437344)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | トパキノン / HAG法 / アミン酸化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，HAG法（湿度調整と水溶性ポリマーのコーティングを用いたタンパク質結晶マウント法）を発展させ，温度やpHが正確に制御された環境下での結晶内の酵素反応を，X線結晶構造解析および結晶顕微分光により直接的に観察することを目的としている．具体的には土壌細菌由来銅含有アミン酸化酵素(AGAO)を試料し，触媒サイクル（酸化的脱アミノ反応）におけるpH・温度に依存した活性中心のコンフォメーション変化と，補酵素TPQの生合成過程における前駆体Tyr残基からTPQへの構造変化の2つに焦点を当てる．開始年度である本年度は，後半のTPQ生合成過程について解析を行った．
補酵素TPQは，酸素および銅イオン存在下で，前駆体Tyr残基から自己触媒的に生成する．このため，まず我々は銅イオン非存在下で大腸菌内にてAGAOを発現，精製し，本酵素の前駆体（Tyr型）結晶を作成した．得られた結晶について嫌気条件下で銅イオンを浸漬し，嫌気状態を保ったままSPring-8へ輸送し，ビームラインに設置されたHAG装置によって本結晶をマウントした．この結晶にさらに酸素（空気）を吹き付けることにより，結晶内でのTPQ形成反応を開始した．酸素添加後，経時的に回折測定を行い，反応を追跡したところ，結晶内で最終的にTPQが形成したことを確認できた．回折実験に並行し，ビームラインに設置されたオンライン型結晶顕微分光装置による測定も行い，分光学的なデータも加えることに成功した．現在，詳細な解析を行っているが，構造変化についての重要な知見が得られ，我々がこれまでに提案した反応スキームをさらに拡張できた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は研究初年度であり，測定条件を決定することと，得られた条件を用いて予備的測定を行うことが目標であった．
本研究を行う上では同程度の大きさの結晶を大量に必要とするため，結晶化条件の見直しをおこなったほか，HAG法に必要な水溶性ポリマーおよび可塑化剤の選定などを行った．これらは比較的早い時点で成功したため，本年度後半は予備的な測定を行った．得られた結果は予備的なものであるが，結晶内で構造が大きく変化することが回折データおよび分光データから観察できた．
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| Strategy for Future Research Activity |
令和二年度で測定条件をほぼ固めることができたので，令和三年度では本測定を行う．実験条件をより細かく振ることにより，より詳細な構造データを得る．また，二つ目のテーマであるpHに依存したコンフォメーション変化についても予備的測定を開始する．
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| Causes of Carryover |
令和二年度は研究費の節約に努めた結果，約50万円程度次年度に繰り越せた．これらは主に結晶調製用の試薬および測定施設（SPring-8）までの旅費に使用する予定である．
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