アミノアシルtRNA合成酵素の新規生理機能の探索とその制御機構の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06537
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 若杉 桂輔 東京大学, 大学院総合文化研究科, 准教授 (20322167)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 蛋白質 / アミノアシルtRNA合成酵素 / 生体分子 / 機能 / 制御機構 / トリプトファン / 免疫寛容

Outline of Annual Research Achievements

アミノアシルtRNA合成酵素はtRNAにアミノ酸を結合させるアミノアシル化反応を触媒する酵素である。我々は、ヒトのトリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)がこの触媒機能に加え、細胞外に分泌された後、血管新生抑制因子として働くことを発見した。また、最近、ヒトTrpRSがインターフェロン-γ（IFN-γ）に応答して発現量が著しく増加し、細胞内から細胞外に分泌され、免疫寛容に関わる細胞外から細胞内へのトリプトファン(Trp) に対する高い親和性と高い選択性を有する高感度なTrp輸送に関わることを発見した。本研究課題では、我々が最近発見したTrpRSを介した高感度なTrp輸送機構を分子レベルで解明することを目指している。癌細胞では、Trpを代謝する酵素が高発現しており、癌周辺のTrpを枯渇させることでT細胞の増殖を抑え免疫寛容が生じることが明らかになっている。これまでに、Trp代謝酵素により誘導されるTrp欠乏状態が細胞外のヒトTrpRS蛋白質による高感度Trp輸送を著しく促進させることを明らかにした。今年度は、Trp欠乏培地中で、ヒトTrpRSを過剰発現させた細胞と通常細胞とを培養し細胞内への高感度Trp輸送を比較解析することにより、TrpRS蛋白質発現がTrp欠乏状態での高感度Trp輸送に直接関与していることを実証した。また、部位特異的アミノ酸置換TrpRSを用いて解析することにより、Trp欠乏状態での高感度Trp輸送にはTrpRSのトリプトファニルAMP形成能が重要であり、tRNAへのアミノアシル化能は重要ではないことも明らかにした。さらに、IFN-γによる高感度Trp輸送の増加にヘム合成が必須であることも明らかにした。今後、Trp欠乏状態により発現量が増加し細胞膜上でTrpRSと相互作用する分子の特定に挑む予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

まず、ヒト野生型TrpRSを過剰発現させたHeLa細胞、あるいは、無処理のHeLa細胞をTrp欠乏培地で培養後、Trpの取り込み量を測定することにより、Trp欠乏条件下、ヒトTrpRSを過剰発現させると通常細胞と比較し高感度Trp輸送が著しく増加することが明らかになった。次に、Trp飢餓条件下、Trpが結合できないヒトY159A/Q194A TrpRS変異体、あるいは、ATPが結合できないヒトA310W TrpRS変異体を過剰発現発現させた細胞の場合には、ヒト野生型TrpRSを発現させた場合にみられたTrpの取り込み量の増加が見られないことも明らかになった。他方、tRNAの結合部位を欠失させたΔ382-389 TrpRS変異体を発現させた場合には、ヒト野生型TrpRSの場合と同様にTrpの取り込み量が増加した。以上のことから、TrpRSによる高感度Trp輸送に、TrpRSのトリプトファニルAMP形成能（Trp結合能とATP結合能）は重要であるが、TrpRSのtRNA結合能は必須ではないことが明らかになった。また、ヒトのtRNAをアミノアシル化できない枯草菌TrpRSを過剰発現させたHeLa細胞をTrp飢餓条件下で培養した場合でもTrpの活発な取り込みが見られたことから、TrpRSへのtRNA結合はTrpRSによるTrpの取り込みに不必要であることが再確認された。さらに、HeLa細胞の培地にIFN-γを添加すると高感度Trp輸送が増加するが、今回、IFN-γ添加とともにスクシニルアセトンを添加しヘム合成を阻害すると高感度Trp輸送が著しく減少し、この細胞にヘムを補充すると高感度Trp輸送が大きく増加することも明らかになった。この実験結果は、Trp代謝酵素がヘム蛋白質であり、ヘムの結合がTrp代謝活性に必須であるためと解釈される。

Strategy for Future Research Activity

今後は、まず、Trp欠乏状態で、ヒトTrpRSと結合する細胞表面の分子を特定することに挑む。次に、相互作用分子のsiRNAを用いて相互作用分子を特異的に欠失させ、TrpRSを介した細胞外から細胞内への高感度Trp輸送における相互作用分子の重要性を明らかにすることを目指す。また、ヒトTrpRSはIFN-γ刺激により発現量が著しく増加するが、IFN-γ刺激時、細胞内には活性酸素種が多く産生される酸化ストレス状態になっており、ヒトTrpRSは翻訳後修飾を受ける可能性がある。そこで、ヒトTrpRSの翻訳後修飾が起こっているアミノ酸残基及び修飾の種類を特定することを試みるとともに、TrpRSの翻訳後修飾と、高感度Trp輸送に関わるTrpRSの機能制御機構との関連を解明することも目指す。