2020 Fiscal Year Research-status Report
Identification of the maturation-inducing hormone receptor in starfish
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20K06538
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
奥村 英一 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (00323808)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 卵成熟誘起ホルモン / 1-methyladenine / 1-メチルアデニン / 受容体 / GPCR / ケミカルジェネティクス / シグナル伝達 / イトマキヒトデ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトデ卵成熟誘起ホルモンの受容体の同定が本研究の目的であり、これまでに申請者が見いだした有力候補であるGタンパク質共役型受容体(GPCR)が真の受容体であるかどうかの解析に着手した。
まず細胞内の候補GPCRが卵成熟ホルモンに対する応答に必要であるか明らかにするため、機能阻害を期待して3種類のペプチド抗体を作成した。それぞれの抗体を抗原ペプチドを用いてアフィニティー精製し、精製濃縮抗体を得た。下流のシグナル伝達に関わるとされる細胞内突出部分を抗原とした抗体については細胞内に注射して阻害効果を調べたが、抗体注射だけでは阻害効果がみられなかった。GPCRは膜局在化であり、細胞質への注射では効率的に結合しない可能性も考えられた。
そこで抗体をGPCRが局在する細胞膜部分へ運搬・濃縮するための機能タンパク質を設計・作成した。その構造の概要は、膜へ局在化する修飾であるミリストイル化を受けるSrc遺伝子ファミリー由来のペプチド配列と、抗体と特異的に結合するProtein A由来のZZドメインを結合したキメラタンパク質である。常活性型Aktキナーゼの作成で実績のあった配列を用いたが、このキメラタンパク質と蛍光抗体と混合して細胞内へ注射しても蛍光抗体の膜への局在は見られなかった。キメラタンパク質の立体構造の不全などの原因が考えられた。
抗体を細胞膜へ標的化する機能タンパク質を改良するため、ミリストイル化修飾だけでなくパルミトイル化も受ける配列に変更して膜への標的化の効率を上げるとともに、立体障害を回避するために、膜標的化配列とZZドメインとの間にスペーサー配列を挿入し、どちらも機能することを期待した。コンストラクを作成し終え、改良版キメラタンパク質の発現・精製まで実施した。次のヒトデのシーズンにキメラタンパク質の機能を確認し、抗体による再度の阻害実験を実施するための準備が完了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
20年度の研究進捗が悪かった一番の理由は、本研究が実験系の研究であるため、COVID-19の影響を強く受けたことである。年度初めから半年程は、研究室への出校自粛状態が続き、在宅で出来る作業は行ったものの、それだけではほとんど研究が進まなかった。研究室へは生物の維持管理のための最低限の出校は許されたため、幸い自粛明けに実験を再開することができたが、感染者が出て消毒する必要が生じた場合には生物材料が完全に使えなくなる恐れがあった。その後、段階的に研究室滞在時間はのびてきたが、現在も出校制限が続いており、研究室での時間をできるだけ効率的に使う努力はしているものの遅れを取り戻すには至っていない。
計画した実験を実施するための時間に制限があったことから、当初の計画内容のうち、これまでに申請者が見いだした受容体の有力候補であるGタンパク質共役型受容体(GPCR)が真の受容体であるかどうかを、抗体を用いた阻害により証明する実験を最優先に実施してきた。そのため、抗体に関する実験はある程度進んだものの、他の計画については実施が遅れて実験準備段階に留まっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究に遅れがあり、また、現在も研究室に滞在する時間に制約があるため、当初は初年度に実施を計画していたものの中でも、特に重要なものを優先して推進していく。
候補GPCRが卵成熟のシグナル伝達に必要であるかを示す実験としては、まず１つ目として、抗体による阻害実験を成立させることを目指す。精製抗体を準備できたもののそれだけでは阻害効果が見られなかったため、抗体を細胞膜へ輸送・濃縮するための機能タンパク質の作成を成功させる。2つ目として、抗体による阻害以外の方法として、モルフォリーノアンチセンスによるGPCRの翻訳を阻害する。合成阻害により、ターンオーバーによる内在性タンパク質量の低下を誘起する。3つ目として、C末端領域の一部を欠損させた変異体GPCRを過剰発現させることで競合阻害を試す。
候補GPCRの十分性を示す実験としては、上記の必要性を示す実験と並行して実施する。まず、一般的にはGPCRはホルモン刺激がなくても低レベルの活性を持つことから、候補GPCRの野生型を過剰発現させて卵成熟誘起を試みる。また、モルフォリーノアンチセンスによる内在性タンパク質の減少に成功した場合には、そのレスキュー実験により、卵成熟誘起シグナル伝達への関与を裏付けたい。
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| Causes of Carryover |
当該年度である2020年度は、COVID-19の影響により研究室内で実験に費やす時間が当初計画の半分もとることが出来なかったため、実際に使用した額が当初の計画よりも下回り、次年度使用額が生じてしまった。特に分子生物学や生化学で使用する試薬には、使用期限が短いものもあり、必要な時に必要なだけ購入することが望ましいため、そうした試薬は研究の進捗の遅れもあり購入を見送っていた。また、出張が禁止や自粛されていた期間も長く、旅費の使用もなかった。
翌年度の使用計画については、本年度に遅れが生じた研究実施計画を翌年度にずらして実施する計画である。ただし、現在も研究室に滞在できる時間に制限があるため、この状況が続くとさらに当初の計画からの遅れが生じることが予想される。それを前提とすると、翌年度の使用は、生じた次年度使用額を研究の進捗に合わせて使用するとともに、その後、翌年度請求分のうちの一部を使用すると考えている。
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