Identification of the maturation-inducing hormone receptor in starfish

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06538
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 奥村 英一 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (00323808)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 卵成熟誘起ホルモン / 1-methyladenine / １ーメチルアデニン / 受容体 / GPCR / ケミカルジェネティクス / シグナル伝達 / イトマキヒトデ

Outline of Annual Research Achievements

ヒトデ卵成熟誘起ホルモンの受容体の同定が本研究の目的であり、申請者がこれまでに見いだした有力候補であるGタンパク質共役型受容体(GPCR)がヒトデ卵で機能する真の受容体であるかどうかを確認しようとしてきた。候補GPCRの細胞外突出部分を抗原とした精製抗体を細胞表層に作用させることで、約半数の卵の卵成熟を完全に阻害することに成功していたが、個体により阻害効果に差があることが問題となっていた。
今年度はこの問題の原因を解析し、この差と対応して複数の細胞周期制御タンパク質のリン酸化状態が異なることを見出した。また低濃度のホルモン処理が同様のリン酸化を誘起したことから、卵成熟誘起ホルモンの作用機構に、低濃度で作用し一部の標的タンパク質が応答しリン酸化されるが成熟には不十分な段階と、高濃度で作用し卵成熟誘起に十分となる２段階あることが示唆された。
また、卵の状態に注意しつつ、候補GPCRの細胞の内側に突出した部分を抗原とした別の精製抗体による阻害方法の改良も試みた。精製抗体を細胞内に注射するだけでは時間的遅れのみの阻害効果であったため、抗体を細胞膜の内側へ標的化するタンパク質を設計して細胞内で効かせることで完全な抑制を目指した。残念ながら数種類試したが阻害効果を高める結果は得られていない。
候補GPCRに対する複数の異なる抗原部位に対する抗体により、完全ではないものの部分的な抑制される結果が得られたため、ヒトデの卵成熟誘起にこのGPCRが関与することが示された。受容体が複数存在する可能性も見出されたが、候補GPCRがヒトデ卵成熟誘起ホルモン受容体の１つであることは間違いないと考えられる。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

研究開始当初はCOVID-19対策として所属機関から出された出校制限により研究の遅れが生じていたが、それについては概ねとり戻していた。しかし、昨年度に抗体を用いた阻害実験の過程で、ホルモン受容体が、１種類で２段階の作用を担うこと、または２種類ある可能性が新たに見出された。これは当初想定していなかった事実で、受容体の同定を目的とした研究をまとめるためには、これらの問題への対処が必要となっていた。今年度は、この問題の原因の解析を進め、いくつか手がかりを得たものの、初めて解析対象となった因子の関与が示唆されたため、解析を進める上での道具や手段が十分でなく、残念ながら解析に時間を要しており今年度内での解決には至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

候補GPCRがヒトデ卵細胞内で卵生熟誘起ホルモンに応答する受容体であるかについては、細胞外突出部位に対する精製抗体による阻害により、その可能性が非常に高いことが示された。しかし、その解析の過程で、卵細胞の状態に違いがあることが判明し、ホルモンの作用機構に２段階あり、この２段階の作用が、１種類の受容体が低濃度と高濃度で使い分けられている可能性と、２種類のホルモン受容体が存在する可能性とが考えられた。受容体同定の目的のためには、どちらであるかは重要な問題であり、今後も引き続きこの問題の解決を目指す。
候補GPCRの働きを抑える方法には、精製抗体を細胞膜の内側に標的化するタンパク質として設計したが昨年度は調製まで至らなかったものがあり、そうした複数種のタンパク質を試す。候補GPCRの関与については、細胞外突出部位を抗原に用いた方法とは異なる方法で抑制することで、受容体の作用機構について解析が進むと期待される。細胞内から抑制した時に、リン酸化状態の差によらず抑制できれば受容体は１種類と言えるし、細胞外突出部位を抗原とした時と同じ結果になれば、２種類存在する可能性が高まる。

Causes of Carryover

研究開始当初にCOVID-19の影響による出校制限があり、実験系である本研究課題においては、当初大きな遅れが生じていた。これについては、これまでに研究計画の多くの目標は遅れを取り戻していた。しかし、昨年度に研究遂行上重要な阻害実験で大きな進展があったが、その解析の過程で想定外の新事実が明らかになり、その点を明らかにする必要が生じていた。今年度はその検証作業を進め、いくつか手がかりが得られたものの容易には進んでいない。そのため予算執行額が当初計画よりも下回り、次年度使用額が生じてしまった。
今後の使用計画としては、物品費については、まずは本研究にとって重要であるが想定外だった新知見に関する解析に必要な研究試薬等を購入する。その後は順次研究目的遂行に必要なものの購入に当てていく。交通費については、今後は遠隔地での採集や学会参加の出張に積極的に使用したい。人件費については、次の補佐員の採用は見送り、その予算を研究に必要な物品費へ振り替える。