Structural study of pro-filaggrin recognition by SASPase

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06540
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 帯田 孝之 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 准教授 (30578696)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: Ｘ線結晶構造解析 / HPLC / filaggrin / 酵素活性

Outline of Annual Research Achievements

アトピー性皮膚炎の発症要因として皮膚のフィラグリン分子の機能異常が知られており、 国内外で盛んに研究されている。近年、アスパラギン酸型酵素SASPaseがプロフィラグリン を限定分解すること、遺伝子欠損マウスでは乾燥肌様皮膚を呈することが示されたが、基質 認識の特異性など、その活性機構は未だ明らかとなっていない。そこで、本研究の大きな目的は、SASPaseの基質認識機構を原子レベルの精度で明らかにすることである。そのため、まず研究計画1年目として、ヒトおよびマウスのSASPaseについて、基質結合型およびアポ型について、さまざまなコンストラクトについて結晶化を試みた。その結果、酵素活性を消失させた変異体に関して、酵素活性ドメイン単独、および全長に関して、それぞれ約２オングストローム、約1.8オングストロームの分解能で反射データを得た。空間群はそれぞれP6122、C2で、単位格子中にそれぞれ2分子含まれていた。セレノメチオニン置換型の結晶を用いて、単波長異常分散法により位相を決定し、モデルを構築後、精密化を終了させた。その結果、酵素活性ドメインは二量体を形成していることと、自己ペプチドが活性部位に結合していることが明らかになった。また、N末端には、機能未知のヘリックスバンドル構造をもつドメインが存在していることが明らかとなった。また、逆相HPLCを用いて酵素活性をおこない、SASPaseが3種類の基質に対して、特異的に活性を示すことを明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究初年度には、Ｘ線結晶構造解析を行う計画であったが、酵素ドメイン単独、および全長のコンストラクトについて、精密化を終了した。また、逆相HPLCを用いた酵素活性測定も開始しており、当初の予定通りに進行していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

これまでのところ、順調に計画が進行している。今後も、予定通りにすすめる。具体的には、研究2年目は、基質との複合体のＸ線結晶構造解析、および、酵素活性測定をさらにすすめる予定である。

Causes of Carryover

2020年度（研究1年目）は、174131円の次年度使用額が生じた。これは、放射光施設での実験に伴う、旅費、人件費、消耗品費などを予定していた分であるが、実際には新型コロナウイルス等により、使用することができなかった。この分に関しては、2021年度（研究2年目）に、消耗品、旅費、人件費・謝金として使用することを予定している。