2021 Fiscal Year Research-status Report
Structural study of pro-filaggrin recognition by SASPase
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20K06540
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
帯田 孝之 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 准教授 (30578696)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 酵素反応 / Ｘ線結晶構造解析 / SASPase / Filaggrin |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アトピー性皮膚炎の発症要因として皮膚のフィラグリン分子の機能異常が知られており、国内外で盛んに研究されている。近年、アスパラギン酸型酵素SASPaseがプロフィラグリンを限定分解すること、遺伝子欠損マウスでは乾燥肌様皮膚を呈することが示されたが、基質認識の特異性など、その活性機構は未だ明らかとなっていない。そこで、本研究の大きな目的は、SASPaseの基質認識機構を原子レベルの精度で明らかにすることである。
これまでに、まず研究計画1年度目に、ヒトおよびマウスのSASPaseについて、基質結合型およびアポ型について、さまざまなコンストラクトについて結晶化を試みた。そして、SASPaseの酵素活性ドメイン単独、および全長に関してＸ線結晶構造を決定した。また、逆相HPLCを用いて酵素活性をおこない、SASPaseがFilaggrin由来の基質に対して、特異的に活性を示すことを明らかにした。次に、研究計画2年度目に、SASPaseとFilaggrin複合体の結晶化をおこない、分解能約1.9オングストロームで反射データを得た。空間群は、P3122で、単位格子中に2分子の複合体が含まれていた。すでに決定した酵素活性ドメイン単独の結晶構造を鋳型として分子置換法をおこない、構造精密化を終了させた。その結果、基質Filaggrin由来のペプチドが、活性部位に結合し、SASPaseが認識している様子が明らかとなった。この活性部位には、酵素活性ドメイン単独の場合には自己ペプチドが結合しており、基質Filaggrinが同じ位置に結合している様子が明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究初年度には、Ｘ線結晶構造解析を行う計画であったが、酵素ドメイン単独、および全長のコンストラクトについて、精密化を終了した。また、逆相HPLCを用いた酵素活性測定も開始した。研究2年度には、SASPase-Filaggrin複合体の結晶構造の決定および構造精密化を終了した。当初の予定通り順調に進行していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでのところ、順調に計画が進行している。今後も、予定通りにすすめる。具体的には、研究３年目は、酵素活性測定をさらにすすめる予定である。
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| Causes of Carryover |
2021年度（研究2年目）は、320351円の次年度使用額が生じた。事前の予定では、放射光施設での実験に伴う旅費、人件費、消耗品費などを予定していた分であるが、実際には新型コロナウイルス感染拡大等により使用することができなかった。また、論文執筆代としても考えていたが、研究3年目に使用することを予定している。これらの分に関しては、2022年度（研究3年目）に、消耗品、旅費、人件費・謝金、論文執筆費として使用することを予定している。
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