光依存型酵素をプラットフォームとした新奇光反応への機能変換

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06542
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 山本 治樹 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (80615451)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 光依存型酵素 / クロロフィル生合成

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では光依存型protochlorophyllide還元酵素(LPOR)に変異を導入し、別の還元反応へ機能変換することを試みる。2020年にシアノバクテリア Shynechosystis sp PCC 6803株のLPORの立体構造が明らかにされ、その基質結合に関わる領域について新しい知見が得られた。この構造情報を元にLPOR上の基質結合部位に特異的なアミノ酸残基変異導入を行い、本来の活性であるprotochlorophyllide還元反応とは異なる触媒反応を光依存的に進める酵素を創出することを目指す。まず最初の機能返還のターゲットとして、LPORの本来の活性であるprotochlorophyllide還元活性の生成物、chlorophyllideに対してさらなる還元反応を行うchlorophyllide還元酵素(COR)に着目する。CORとLPORは基質の構造が非常に類似している点、触媒する反応がともに炭素の二重結合の還元反応である点など、触媒する反応の反応機構が近く、機能変換が最も起こりやすいと考えた。2020年度はCOR活性を持つ変異LPORを検出するための基盤として、光合成細菌Rhodobacter capsulatusのCOR欠損株(bchY-bchZ欠損)を作成し、その株を用いた表現型の解析を行った。その結果、COR欠損株は通常の好気敵な生育条件では野生型と同様に扱うことができるが、光合成条件において全く生育しないことが示された。ポジティブコントロールとしてbchY-bchZの遺伝子をプラスミドによって導入すると、光合成条件での生育能が相補された。このことから、このCOR欠損株において、多様な変異を含むLPOR発現プラスミドを導入すれば、COR活性を持つものだけがこの光合成条件での生育を相補できると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上述のように、2020年度は変異LPORのうち、COR活性を持つものを大規模にスクリーニングするための基盤の作成に成功した。光合成細菌Rhodobacter capsulatusのCOR欠損株は完全にバクテリオクロロフィル生合成能を失っており、嫌気的な光合成条件では全く生育できないことを確認した。この株において僅かでもCOR活性が相補されれば、光合成条件での生育が回復し、同条件でコロニーとして変異LPORを発現する形質転換体の単離が可能となると考えられる。COR欠損株がCOR遺伝子の相補によって、光合成生育能が回復することも確認されたため、COR遺伝子破壊による周辺遺伝子への極性効果も限定的であることが示された。これにより、in vivoでの高い精度でCOR活性を評価できる基盤が確立したと考える。

Strategy for Future Research Activity

光合成細菌R. capsulatusのCOR欠損株の作成によって、COR活性を持つ酵素の大規模なスクリーニングが可能となった。変異を導入したLPORをこの光合成細菌の変異株に導入する前に、まずLPOR自体が光合成細菌の中で機能的に発現しうるか検証を行う。構造情報の明らかとなったシアノバクテリア Shynechosystis sp PCC 6803株のLPORを光合成細菌において発現させ、本来の酵素として機能しうるかをLPORと同じ反応を触媒するDPORという酵素の欠損株を用いて確かめる。COR欠損株と同様にDPOR欠損株も光合成的な生育ができないと予想され、LPORの導入による光合成能の相補によりLPORの機能発現を評価する。その後、LPORにおける基質結合部位に特異的なランダム変異を導入したライブラリを作成し、それら変異LPORライブラリを光合成細菌に導入してスクリーニングを行う予定。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス感染症の感染状況により、参加を予定していた会議が中止、延期またはオンライン開催となり、旅費として計上した予算が使用されなかった。次年度と合算して使用するが、差額が少額であるため、次年度の研究計画を特に変更しない。