2022 Fiscal Year Research-status Report

光依存型酵素をプラットフォームとした新奇光反応への機能変換

Research Project

Project/Area Number	20K06542
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	山本治樹名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (80615451)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	光合成細菌 / クロロフィル / 光依存型酵素
Outline of Annual Research Achievements	本研究課題では光依存型protochlorophyllide還元酵素(LPOR)に変異を導入し、別の還元反応へ機能変換することを試みる。まず最初の機能返還のターゲットとして、LPORの本来の活性であるprotochlorophyllide還元活性の生成物、chlorophyllideに対してさらなる還元反応を行うchlorophyllide還元酵素(COR)に着目した。2022年度はLPOR変異ライブラリの規模を拡大し、光合成細菌Rhodobacter capsulatusのCOR欠損株を用いて大規模なスクリーニングを実施した。これまで70,000種類以上の変異LPORをスクリーニングしたが、COR活性を相補する変異LPORは得られていない。本研究で確立したCORの活性評価を利用し下記の二つの異なる活性を持つCORの機能変換のメカニズムについて解析を行った。 CORはクロロフィリドaのB環の炭素二重結合を還元しバクテリオクロロフィリドaへ変換する反応を触媒する。しかしBchl bを主要色素として保持する光合成細菌Blastochloris viridisの保有するCORはB環の二重結合の還元ではなく、8ビニル-クロロフィリドaに対してエチリデン基の生成を行う。このように二つの異なる活性を有するCORが報告されているが、どのような違いにより活性が決定づけられているかは不明である。活性の違いを決定づけるアミノ酸残基を特定するため、COR欠損株を用いて活性の評価を行った。この株にB. viridisのCOR遺伝子bchY-Zを導入した株は光合成的には生育しないが、長期の培養により光合成的に生育するリバータントを取得した。リバータントが保持するbchY-Z遺伝子の配列解読からCORの活性を決定づけるアミノ酸について考察する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2020年度までに構築した光合成細菌Rhodobacter capsulatusのCOR欠損株を用いたin vivo相補により大規模なLPORライブラリからCOR活性を保持するものをスクリーニングする実験系を構築した。2021年度に引き続き、ランダムな塩基置換を含む変異LPORライブラリの作成およびその機能評価を中心に実施した。COR欠損株のスクリーニングは光合成条件で行うことにより、変異型LPORによりCORの機能が相補された株の取得を試みているが、現在までのところそのような株は得られていない。新たに二つの異なる活性を持つCORの機能変換について、本研究で確立したCOR相補系を利用して解析を開始した。B. viridisの持つCORをR. capsulatusのCOR欠損株で発現させたところ、光合成的には生育しなかったが長期の培養で光合成生育能すなわちバクテリオクロロフィル生合成が相補されたコロニーが出現した。それらのコロニーが保持するCOR遺伝子の配列を解析したところアミノ酸変異を引き起こす塩基置換が生じていたことが確認された。これらのアミノ酸置換によりB. viridisの持つCORがR. capslatusの持つCORの機能へと変換した可能性が高い。
Strategy for Future Research Activity	変異LPORライブラリの作成については、異なるライブラリを掛け合わせてさらに多様な種類の変異を含むLPORライブラリの調整も試みる。またCOR欠損株を用いた2種類のCORの機能変換については光合成生育能を獲得した復帰変異株が保持するCORの配列を解析することで、どのような部位のアミノ酸がCORの機能を決定づけているか検証する。そしてそれらのアミノ酸変異が実際にCORの活性を変換していることをin vitroの生化学実験で実証を試みる。
Causes of Carryover	初年度から続く新型コロナウイルス感染症の影響により、参加を予定していた会議が中止、延期またはオンライン開催となり、旅費として計上した予算が使用されなかった。また購入予定であったタンパク質精製用のFPLC装置は、タンパク質の精製が必要な段階には到達しなかったため購入していない。 2023年度はCORの機能変換を中心に、復帰変異株の取得、変異部位の特定、CORの活性の確認を予定する。