Analysis of molecular mechanism of lysophospholipid transporters

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06544
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 西 毅 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (60403002)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: スフィンゴシン１リン酸 / 輸送体 / SPNS2 / 構造機能相関

Outline of Annual Research Achievements

本研究では近年明らかになりつつあるリゾリン脂質シグナリングにおいて申請者らが見出したS1P輸送体SPNS2とMFSD2BによるS1P輸送と受容体活性化までのシグナル伝達の分子機構を明らかにすることを目的としている。これまでに引き続きS1P輸送体であるSPNS2のスフィンゴシン１リン酸（S1P）輸送機構に必須な残基の同定を目指して部位特異的変異導入を進めることで、S1P輸送に必須なアミノ酸残基と基質認識に関わるアミノ酸残基を複数残基見出した。さらに同じS1P輸送体であるがSPNS2とのアミノ酸配列の相同性が60%程度しか一致しないMFSD2Bでも変異導入を進め、SPNS2とは大きく異なる位置に機能に関与するアミノ酸残基を同定した。SPNS2とMFSD2Bの機能残基の位置と高次構造での配置を他のMFS型輸送体の結晶構造を用いてモデリングすることで比較し、S1P輸送機構について推定した。
また、輸送体の高次構造を同定するためのタンパク質の大量発現系と精製法の検討を進め、比較的大量にタンパク質を得ることができるようになった。これらの条件をさらに至適化することで結晶構造解析に使用可能なサンプルの作成を進めた。
実際の細胞においてS1P輸送体がどのようにS1Pを輸送しているかを調べるため、細胞の細胞膜上においてS1PとS1P輸送体の相互作用を、S1Pの蛍光標識化合物とGFPとの融合タンパク質として発現させたSPNS2とで細胞膜での動態の観察を検討したが、有意な結果が得られなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コロナウイルス感染症の影響で研究を通常通り実施できない期間や、予定していた研究補佐員の雇用などが予定通りには進まなかったなど、研究実施環境が不十分であったたため、当初の予定通りには研究が進められなかった。

Strategy for Future Research Activity

今後はこれまでに明らかにしているSPNS2およびMFSD2BのS1P輸送機構に必須な残基に加えて、新たな必須残基の探索を進めることで、SPNS2とMFSD2Bという異なるS1P輸送体によるS1P輸送機構について明らかにする。さらに高次構造の決定を目指して、SPNS2およびMFSD2Bの大腸菌もしくは培養細胞での大量発現系の構築と最適化を進める。また、タンパク質の精製、結晶化条件の最適化を進め高次構造の決定を目指す。

Causes of Carryover

本年度の研究予定通り進まなかったため、本来使用予定であった分子生物学実験や生化学実験、特にタンパク質の大量発現や精製に関わる費用については翌年度に使用する予定である。また、本年度雇用できなかった、研究補佐員の経費としても使用することで、研究計画の一層の推進を目指す。