2020 Fiscal Year Research-status Report
Mechanism of DNA synthesis-activated proteolysis for genome integrity
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20K06547
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
西谷 秀男 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (40253455)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ゲノム / DNA複製 / タンパク質分解 / PCNA / Cdt2 / リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生命の連続性は、ゲノム情報の正確な維持継承により成り立つ。細胞周期において染色体
の複製は一度だけに限定される。この制御に、PCNAに依存したCRL4-Cdt2ユビキチンリガー
ゼによるタンパク質分解が重要な働きをする。PCANは複製が始まりDNAにロードされると、
染色体複製に関わる多数の因子が結合する足場となり、それらの働きを補佐する。PCNAの新たな機能として、DNA複製のライセンス化因子Cdt1が結合すると、CRL4-Cdt2によるCdt1のポリユビキチン化を介した分解を引き起こし、再複製を抑制することが分かってきた。また、紫外線などによるDNA損傷時にも同様に作動し、ゲノム維持に必須の機能を果たす。本研究では、CRL4-Cdt2がどのようにして、複製が開始してPCNAがクロマチンに結合した時のみ分解を引き起こすのか、そして、細胞周期の進行に伴いどのようにその活性が制御されるのか、に焦点を当てその仕組みの解析を進めている。
本年度の成果として、１）レーザーによるDNA損傷を誘発後、ライブイメージング法でmCherry-Cdt2の損傷部位への集積キネティクスを解析する方法を導入した。DNA損傷部位にmCherry-Cdt2が数分後に集積する様子を観察した。２）Cdt2のCDK-サイクリンによるどのリン酸化がPCNAとの結合を抑制するか調べるため、Cdt2-C末端（390-730)で確認した。この領域のCDKリン酸化部位18変異でもWTに比べて、PCNAとの結合が増強していることを確かめた。３）Cdt2C末の(460-580)にDNA結合活性があることを報告したが、さらに限定するために、塩基性アミノ酸に富む前半と、後半側に分けてタンパク質を精製したところ、両領域とも結合能を消失していたので、(460-580)全体か、分割した領域に結合能があると判断した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
次にまとめるように、一定の成果が得られている。
１）手間のかかる精製タンパク質を用いたDNAにロードされたPCNAとのCRL4-Cdt2の結合を調べる方法として、レーザーによるDNA損傷を誘発後、mCherry-Cdt2の損傷部位への集積キネティクスをライブイメージング法で解析する方法を導入した。DNA損傷部位にmCherry-Cdt2が数分後に集積する様子を観察した。この方法により、今後各種変異Cdt2を作成して解析を進めることが可能となった。
２）Cdt2C末の(460-580)にDNA結合活性があることを報告したが、さらに限定するために、塩基性アミノ酸に富む前半と、後半側に分けてタンパク質を精製したところ、両領域とも結合能を消失していたので、(460-580)全体か、分割した領域に結合能があると判断した。
３）Cdt2のCDK-サイクリンによるリン酸化がPCNAとの結合にネガティブに働くことを報告したが、どの領域のリン酸化が抑制効果を持つのか不明なため、Cdt2-C末端（390-730)でのみ効果があるのかどうか確認した。CDKリン酸化部位18変異でもWTに比べて、リン酸化が低下し、PCNAとの結合が増強していることを確かめた。また、論文にて報告された網羅的なタンパク質のリン酸化解析データをもとに、実際にリン酸化が検出されているCdt2の６部位に変異を導入した発現プラスミドを構築した。安定発現細胞の構築を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）mCherryと融合したCdt2のN末のみ、PIPbox、DNA結合部位、あるいはCDKリン酸化18部位の変異体を作成し、ライブイメージングにて、DNA集積キネティクスを調べる。細胞周期での違いがないか比較する。
２）論文にて報告されたCdt2のリン酸化部位のうちCDKリン酸化部位に対応する６箇所をアラニンに変異したCdt2を作成したので、安定発現細胞を調整したのち、PCNAとの結合を免疫染色および免疫沈降により確認する。効果があれば、さらにリン酸化部位を絞っていく。
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| Causes of Carryover |
（理由）
講座費による消耗品の購入が可能となり、また学会がwebにより実施されたため参加旅費が不要となり、未使用が発生した。
（使用計画）
本年度分の研究費と合わせて、研究の遂行のため適切に使用する。
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Research Products
(4 results)
