抗転移細胞で特異的に発現するタンパク質の分子機序解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K06554
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 富田 毅 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (20302242)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: タンパク質間相互作用 / プルダウンアッセイ

Outline of Annual Research Achievements

ZC3Hタンパク質の発現系を構築し、ヒト培養細胞(HEK293T)およびマウス培養細胞(RAW264.7)において標的蛋白質を過剰発現させた。これらの細胞抽出液から、タグ抗体ビーズを用いて標的蛋白質をプルダウンさせたのちに、その産物を電気泳動により分析した。得られた結果から、標的蛋白質以外にもいくつかのバンドが見られたので、これらのバンドを切り出し、プロテアーゼ消化の後にLC-MSMSによる解析を行い、バンド中に含まれるタンパク質を同定した。またこれらの実験と並行して、機能的に関係があると思われるタンパク質の発現コンストラクトを構築し、それらをHEK293T細胞を用いて、ZC3Hタンパク質との共免疫沈降を行うことにより、相互作用の可能性があるかどうかを調べた。これらの実験結果から、いくつかのタンパク質がZC3Hタンパク質の細胞内機能に関係する可能性が示唆されている。また、ZC3H発現細胞にUVを照射後にZC3Hタンパク質を抗体ビーズでプルダウンし、ビーズを洗浄後に、ビーズに結合している核酸を次世代シークエンシングの手法で解析した。解析結果から、結合核酸の大半はリボソーム由来のものであり、非特異的吸着によるものと考えられたが、一部の核酸は特異的な結合によるものと判断された。これらの核酸にコンセンサス配列があるかどうかを調べたが、明確なコンセンサス配列は現時点では見つかっていない。なおこれらの核酸結合に再現性があるかどうかを定量PCRの手法で確認し、再現性が取れることを確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

COVID-19の影響により、共同研究先で実験することが不可能になった。このため、一部の測定実験などが、実行不可能となったことに伴い、実験手法の変更をおこなったため。

Strategy for Future Research Activity

本研究の成果の一部は、現在投稿中の論文に含まれている。論文中に使用しているデータに基づき、さらに発展的な内容の実験を行う計画を立てている。論文はリバイス中であり、論文成立のためには大量の追加実験が必要であるため、まずは投稿論文の成立に全力を尽くしたい。

Causes of Carryover

2021年2月または3月に出張を予定していたが、中止したこと、および一部の物品の納入が４月以降にずれてしまったため。次年度使用額は4月に納品予定の物品購入に使用し、令和3年度請求額は当初の予定通り、消耗品費や論文投稿費として使用する計画である。