2021 Fiscal Year Research-status Report
マラリア原虫のアルテミシニン耐性においてフェレドキシンの変異が果たす役割の解明
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20K06557
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
木股 洋子 山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授 (60255429)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齊藤 貴士 北海道科学大学, 薬学部, 准教授 (00432914)
小崎 紳一 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (40280581)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | マラリア原虫 / 薬剤耐性 / フェレドキシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、マラリア原虫の特効薬であるアルテミシニンへの耐性の拡大を阻止することを目的とし、この耐性と強く関連するフェレドキシン(Fd)の変異（Asp97Tyr）が薬剤耐性をもたらす機序を明らかにすることを目指す。初年度には、このFd変異がFdの主要なパートナー酵素であるFd-NADPH酸化酵素(FNR)との親和性を大きく増加させる一方、電子伝達活性を低下させることがわかった（Journal of biochemistry, 2021）。このFd機能変化がマラリア原虫の還元力供給系やその下流代謝におけるアルテミシニンへの応答に影響をもたらすことが考えられたため、令和３年度は、これらFd関連反応へのアルテミシニンの影響を以下のように調べた。
マラリア原虫の様々な代謝系への還元力供給は、NADPH/FNR/Fd/Fd依存代謝酵素群、というレドックスカスケードによって行われる。このカスケードのうち、
１）NADPHからFNRへの電子伝達活性はアルテミシニンによってマイルドに阻害され、その主な原因は、NADPHのFNRへの親和性の低下だった。In silico ドッキング解析から、アルテミシニンがFNRへのNADPHの結合を阻害することが支持された。
２）FNRからFd（野生型およびAsp97Tyr変異体）への電子伝達活性にはアルテミシニンによる有意な阻害はみられなかった。
３）FNRおよびFd）からアルテミシニンへの電子伝達は検出されなかった。
これらのことから、Fdはアルテミシニンの直接のターゲットではなく、Fdの変異がFNRやFd関連代謝に影響し、アルテミシニンが引き起こす酸化的ストレス応答を抑制することにより耐性をもたらすことが考えられた。これらの成果を学会で発表し、論文発表した（Antioxidants, 2022）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和２年度は①マラリア原虫フェレドキシン(Fd) のAsp97Tyrの変異によってそのタンパク質機能が変化することを見出し、令和３年度では、②Fdが関わる反応系に対するアルテミシニンの影響を解析して成果を学術論文および学会発表した。Fdの変異によるタンパク機能変化の解析および、NADPH/FNR/Fd/Fd依存酵素（現在所持している酵素での）カスケード系のin vitroでのアルテミシニン応答解析については、予定していた解析計画を概ね終了している。マラリア原虫Fdの依存代謝酵素の調整については、酸化的条件で不安定な構造をもつイソプレノイド合成系のIspG の調整に難航しているが、FdとFd依存酵素への電子伝達にアルテミシニンが直接寄与しない可能性も考えられたので、アルテミシニンによる酸化的ストレス応答の解析と並行して行うことを検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究から、FdのAsp97Tyr変異がアルテミシン耐性をもたらす仕組みとして、この変異によるFNRとの親和性の上昇（あるいは電子伝達活性の低下）が、アピコプラストの還元力供給系やその下流代謝に影響し、薬剤への耐性をもたらすことが考えられた。また、in vitro系におけるFd関連反応へのアルテミシニン投与の影響の解析から、Fdはアルテミシニンの直接のターゲットではなく、FdのAsp97Tyr変異が、FNRやFd関連代謝に影響して、アルテミシニンが引き起こす酸化的ストレスを抑制することが考えられた。近年、マラリア原虫の高温処理や薬剤による酸化的ストレス下で、HSP蛋白に加えてイソプレノイド合成系の遺伝子発現が特異的に上昇することが報告された。また、最近、マラリア原虫と同じアピコンプレクサ門に属する藻類がサンゴ共生体の中に多数存在することが見出され、マラリア原虫の祖先的な位置付けが考えられた。したがって令和４年度は、マラリア原虫のイソプレノイド合成系のIspG以外のFd依存酵素(IspH)の調整と機能解析を行うとともに、一般の研究室では培養ができないマラリア原虫のモデル生物として、代表者の研究室で培養可能なサンゴ共生体（褐虫藻）における、Fd,FNR,イソプレノイド合成系の酵素や、酸化的ストレス応答遺伝子の発現解析を計画している。
これらの実験結果を総括して、マラリア原虫Fdの変異によりアルテミシニン耐性がもたらされる仕組みの詳細を提唱し、細胞レベル、臨床レベルでの検証に繋げる。
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| Causes of Carryover |
マラリア原虫のFdから電子を受け取る下流酵素の候補の調製において、はじめに行ったIspG酵素の発現系では有意なタンパク質発現が得られていないため、発現系や条件の検討を行い、進捗が見られてから他の候補タンパク質の発現系を検討することにした。従って、それらのDNAを全合成し、発現系を構築する費用を次年度に繰り越すことにした。また、コロナ禍で学会など情報収集や発表の機会が限られたため、令和3年度で得られた成果の発表のための旅費や論文掲載料を次年度で使用する予定である。
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Research Products
(4 results)
