2022 Fiscal Year Research-status Report
マラリア原虫のアルテミシニン耐性においてフェレドキシンの変異が果たす役割の解明
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20K06557
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
木股 洋子 山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授 (60255429)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齊藤 貴士 北海道科学大学, 薬学部, 准教授 (00432914)
小崎 紳一 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (40280581)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | マラリア原虫 / 薬剤耐性 / フェレドキシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、マラリア原虫のプラスチドに存在するフェレドキシン(Fd)の変異（Asp97Tyr）が、原虫の特効薬であるアルテミシニンへの耐性と強く関連することが報告された。本研究では、このFdの変異が薬剤耐性をもたらす機序を明らかにすることを目的として、このFdの変異によるタンパク機能の変化やFd依存酵素との電子伝達機能への影響、アルテミシニン応答への影響を詳細に調べている。令和３年度までに、
・このFd変異がFdの主要なパートナー酵素であるFd-NADPH酸化酵素(FNR)との親和性を大きく増加させる一方、電子伝達活性を低下させることがわかった。
・in vitro再構成系でのアルテミシニン添加実験から、Fdはアルテミシニンの直接のターゲットではなく、Fdの変異がFNRやFd関連代謝に影響することにより耐性をもたらすことが考えられた。これらの結果から、Fdの変異がFNRとの親和性を大きく変えることが、FNRが関わる種々の酸化的ストレス応答反応に影響し、薬剤耐性に寄与することが考えられたため、令和４年度は、
・FdおよびNADPHによるFNRの反応制御の分子メカニズムを、構造や機能情報が豊富な植物型FNRを用いて、詳細に解析し論文および学会発表した。この結果からマラリア原虫Fdの結合によるFNR反応制御の仕組みについて知見が得られた。
さらに、近年、マラリア原虫の高温処理や薬剤による酸化的ストレス下で、イソプレノイド合成系の遺伝子発現が特異的に上昇することが報告された。従って、イソプレノイド合成系などのFd依存代謝の変動が薬剤耐性に寄与することが考えられ、その仕組みを遺伝子発現レベルで調べることにした。そこで、令和４年度は、
・マラリア原虫と同じアピコンプレクサ門に属し、マラリア原虫の祖先的な位置付けが考えられたサンゴ共生体（褐虫藻）を用いて、そのFd,FNR,イソプレノイド合成系の酵素や、酸化的ストレス応答遺伝子の発現解析を行う系を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Fdの変異がもたらすタンパク質の性質及び機能の変化の解析については、概ね計画通り終了して論文発表しているが、変異による変化が予想される酸化還元電位の測定については、Fdを結合させた電極を用いる当初の実験が難航したため、滴定による電位測定に変更することにした。その実験のために再度の野生型及び変異Fdサンプルの大量調整を行うところまで終了している。Fdが関わる反応に対するアルテミシニンの影響は、手持ちの酵素では計画通り終了し、論文発表している。新規なFd下流酵素の調整については、酵素が酸化的条件で不安定と考えられたので、精製のために厳密な嫌気チャンバーの必要性が生じ、条件の検討を行っている。また、マラリア原虫でのFdが関与する酸化的ストレス応答の仕組みを調べるために、新たにマラリア原虫モデル生物を用いた、酸化的ストレス応答遺伝子の発現解析を行う系の構築に着手した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究から、FdのAsp97Tyr変異によるFNRとの親和性の上昇などが、アピコプラスト内の還元力供給系やFdの下流代謝に影響し、薬剤への耐性をもたらすことが考えられた。また、in vitro系におけるFd関連反応へのアルテミシニン投与の影響の解析から、Fdはアルテミシニンの直接のターゲットではなく、FdのAsp97Tyr変異が、FNRやFd関連代謝に影響して、アルテミシニンが引き起こす酸化的ストレスを抑制することが考えられた。植物において、FdとFNRは、酸化還元代謝の要として環境や薬剤などへのストレス応答を行うことが知られている。そこで、今後はマラリア原虫の酸化的ストレス応答にFd、FNR、およびFd関連タンパクが関わる仕組みを、in vivoモデル系で解析する。
また、薬剤耐性をもたらす変異Fd(C末端領域のD97Y)の機能変化の分子基盤として、Fdの酸化還元電位が大きく変化している可能性が考えられるため、従来計画していた電極を作成する方法から変更して、滴定による測定を行う。C末端領域の種々の変異体を持っており、構造―電位相関の解析を計画している。その結果から、原虫薬剤耐性をもたらすFdの分子基盤を明らかにしたい。
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| Causes of Carryover |
マラリア原虫のFdから電子を受け取る下流酵素の候補であるIspG、IspH酵素のホロタンパク調整において、その鉄硫黄クラスターが通常の大気条件で不安定と考えられたので、精製のために厳密な嫌気チャンバーの必要性が生じ、条件の検討を行っている。従って、それらの発現・調整系を構築する費用を次年度に繰り越すことにした。また、コロナ禍および紛争の影響で、機能解析に必要な高額の試料（チトクロムcなど）の納入時期が繰り返し延長し、値段の変動も数倍と大きかったため、他の試薬や精製に必要な装置の購入を保留せざるを得なくなり、最終的に、試薬の納入が期限までに間に合わないことが判明したため、購入予定の物品や装置を次年度にすべて持ち越さざるを得なくなった。上記の報告結果の実験は、前年度購入した残りの試薬で賄った。
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