2021 Fiscal Year Research-status Report
Cellular and molecular mechanisms of systemic dsRNA spreading
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20K06561
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
出嶋 克史 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (60457439)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 亜鉛輸送体 / C. elegans / RNAi / 小胞輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
二本鎖RNAやマイクロRNAをはじめとする機能的なRNAは、標的となるRNAの塩基配列特異的に遺伝子の発現を調節する働きを有する。機能的なRNAの中でも二本鎖RNAはRNA干渉 (RNAi)により標的RNAの分解を引き起こす。機能的なRNAは基本的には細胞内で働く分子であるが、一部は細胞外へ放出され、隣接する細胞や遠隔の細胞に取り込まれて細胞非自律的に遺伝子発現を担うことが知られる。こうした特性から、病気の原因となるような遺伝子の発現を抑えるような目的で機能的なRNAは核酸医療薬へ応用できる可能性を秘めている。しかしながら、細胞外の機能的なRNAが細胞間を伝播する分子機序についての理解は乏しい。線虫C. elegansにおいては、高等生物における機能的なRNAの標的細胞への伝播と類似する現象として「全身性RNAi」という現象が知られる。これまでに、「全身性RNAi」に着目することで、ある種の亜鉛輸送体や亜鉛が機能的なRNAの取り込みを負に調節することを見出してきた。本研究では、亜鉛の標的となる分子の探索と解析を行い、亜鉛を介した機能的なRNAの細胞間伝播メカニズムの理解を目指している。これまでに、同定した新規全身性RNAi関与因子の基本的な特徴（遺伝子発現パターンや、細胞内局在パターン、遺伝子ノックアウト時の表現型など）についてのデータを取得してきた。また、この分子と既知の全身性RNAi関与因子との遺伝学的な関係性も明らかにしている。加えて、この分子の機能阻害により亜鉛代謝に影響が生じる点や、亜鉛輸送活性を持たないと考えられるフォームではレスキュー活性を示さないことなどを見出している。今年度は、亜鉛輸送体が輸送する亜鉛が作用する可能性のある候補分子の解析を中心に行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、線虫C. elegansにいて亜鉛輸送体の一つが全身性RNAiに関与することを明らかにしている。しかし、本分子が高等生物においても同様な役割を果たすかという点については不明であった。そこで、まずヒトのオーソログ遺伝子をクローニングし、線虫変異体におけるRNAi異常の表現型をレスキューさせる活性があるかどうかを調べた。線虫の遺伝子と比べるとレスキュー活性が著しく低いものの、ヒトオーソログ遺伝子は線虫における全身性RNAiが効きやすくなるという異常を有意にレスキューすることがわかった。従って、この輸送体の活性は線虫とヒトで保存されていると考えられる。候補遺伝子スクリーニングで亜鉛によって制御をうける可能性のある分子のうち、全身性RNAiを正に制御する遺伝子及び、負に制御する候補遺伝子複数見出している。負に制御する候補遺伝子の変異体と亜鉛輸送体の二重変異体を作成し、全身性RNAiの効率を比較した。興味深いことに、これらのうちの一つの転写因子をコードする遺伝子の変異体が亜鉛輸送体のRNAi亢進表現型を更に増強させたことから、亜鉛輸送体と協調または並行して全身性RNAiを負に制御する可能性が示唆された。この転写因子をGFPを融合させたコンストラクトを有するトランスジェニック線虫を線虫ストックセンターから取り寄せ発現を調べたところ、全身で発現していることが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
同定している亜鉛輸送体が輸送する亜鉛の標的が何かという点については依然として明らかではないが、亜鉛輸送体と協調または並行して全身性RNAiを負に制御する可能性のある転写因子を見出した。今後、亜鉛や亜鉛キレーターによって表現型にどういう影響があるかということや、既知のRNAi関連遺伝子との遺伝学的作用を調べ、その分子経路を明らかにする。またこの分子に関して、modENCODE projectでChipSeq解析がすでになされており、その解析結果を調べたところ、複数の全身性RNAi関連遺伝子の上流1.5 kb以内にそのの結合配列があることがわかったので、変異体でこれら標的候補遺伝子の発現がどうなっているかという点をRT-qPCRなどの手法で明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
（理由）世界的な物流の混乱もあり、購入しようとした物品が年度内に届かないことがあり、次年度に購入納品と変更したものがある。また、消耗品として、遺伝子工学（enzymes: DNA polymerase, RNA polymerase, restriction enzymes, purification kits, DNA sequencing etc.）やイメージングに要する試薬、プラスティック器具などを購入する予定であったが、一部の解析が予定通りに進まなかった、あるいは、遺伝子破壊など、一部の手法を効率的に進めることができたため、次年度使用額分の未使用金が生じた。（使用計画）更なる実験の効率化に努めて、当該年度に計画していた実験を速やかに次年度に行い、遺伝子工学やイメージングに要する試薬や物品を中心に購入を計画している。
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Research Products
(1 results)
