2021 Fiscal Year Research-status Report
Interaction analysis bewteen subunits of bacterial cellulose synthase
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20K06570
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
于 健 北海道大学, 先端生命科学研究院, 特任助教 (20587860)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | バクテリアセルロース / 合成酵素 / 相互作用 / 構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
セルロースは自然界に最も豊富に存在する高分子であり，主に植物，そして藻類や一部の微生物，さらにはホヤなどの動物によっても合成される．そのうち，バクテリアが合成するバクテリアセルロース(BC)は複雑で密な網目構造を形成しており，高い純度，高い強度，高い保水性を持つという特徴がある．優れた性質を持つBCが新規材料として期待されている一方，BC合成機構が未解明のため，大量生産も困難である．本研究では，BC合成酵素構成因子の相互作用の解明，さらに，マルチ構造解析手法（X線小角散乱，電子顕微鏡法）によって立体構造解析，そしてin vivoでの酢酸菌の合成活性測定での機能解析によりBCの合成メカニズムを明らかにする．BCの生産性向上や機能性BC創製のための分子基盤情報を提供することを目的としている．
令和3年度には，引き続きBcsA-BcsBとBcsDの相互作用解析を行った．昨年度に使用したセルラーゼに, 純度や反応条件などの問題を解決するため，Bacillus subtilis由来のセルラーゼBscel5Aの使用を試みた．まず，Bscel5Aの大量調製を行い，酢酸菌により生産したBCの分解活性を確認することができた．次に，Bscel5A濃度を含める反応条件をた探索した．その結果，BcsA-BcsBとBcsDの複合体形成は、BcsA-BcsBによって生産されたBCを介して結合していることが明らかになった．また，ネガティブ染色電顕でBcsA-BcsB-BcsDを観察したが，全体的にタンパク質の凝集も多く見られた．今後，単粒子の構造解析には，界面活性剤の濃度検討と,タンパク質濃度の検討をする必要がある.
また，BcsCについて、その膜貫通ドメインの精製の改善ができ，結晶化までを進めることができた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
１．BcsA-BcsB-BcsD大量調製について：大腸菌発現系でBC生産菌由来のTC構成因子BcsA-BcsB-BcsDという膜複合体の培養・精製などの条件を最適化し，特に、BcsBの分解を抑えることができ，相互作用などの実験に適用できる大量なサンプル調製に成功した．
２．BcsA-BcsBとBcsDの相互作用解析について：Bacillus subtilis由来のセルラーゼBscel5Aの使用を試みた．
２－１．まず，共同研究先が提供されたBscel5Aの発現ベクターを用いて、Bscel5Aの大量調製に成功した．次に、酢酸菌を培養してBCを生産して精製したBscel5AのBC分解活性を測定した．その結果，Bscel5AはBCを分解する機能を持つことが確認できた．
２－２．ニッケルアフィニティー精製後のBcsA-BcsB-BcsDに精製したBscel5Aを加えた解析を行った．様々な反応条件を検討した結果，BcsA-BcsBとBcsDの相互作用はBcsA-BcsBによって生産されたBCを介していることが明らかになった．
３．BcsA-BcsB-BcsD構造解析について：大量調製したBcsA-BcsB-BcsDを用いてネガティブ染色の電顕で観察を試みた．ニッケルアフィニティー精製後のサンプルは、ゲル濾過精製後サンプルより，BcsA-BcsB-BcsD複合体のような粒子が多く見られていた．恐らく，BCを介していたBcsA-BcsBとBcsDの相互作用が弱いことを示唆している．また，全体的にタンパク質の凝集も多いため，今後，界面活性剤の濃度含む測定条件の検討が必要である．
４．BcsCについて：BcsCの膜貫通ドメインBcsC-Cの精製条件（界面活性剤の濃度,TEVの濃度,精製カラム）の改善をいろいろ検討した．収量が0.4mg/1Lまでにでき,結晶化へ進めることができた．
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| Strategy for Future Research Activity |
BcsA-BcsBとBcsDの相互作用を明らかにしたのでまず，結果をもとめて論文作成・投稿を進める．次に，結晶構造解析と単粒子の構造解析に集中的に進める．
１．引き続き、精製条件の最適化によって，BcsA-BcsB-BcsD複合体，およびBcsCなどの各構成因子の大量調製の改善を行う．特に，BcsA-BcsBとBcsDの界面活性剤などの最適化によって，サンプルの精製量と純度の改善を行う．
２．BcsA-BcsB-BcsDの単粒子の構造解析について，まず，ネガティブ染色の電顕での観察によって，サンプルの状態を確認する．単粒子の画像が得られたら，クライオ電顕を試みる．ネガティブ染色の電顕実験は，当研究室が属している部局の共通機器を使用するが，クライオ電顕は，大阪大学蛋白質研究所や放射光施設PF，SPring-8の共同利用する予定である．
３．BcsCの膜貫通ドメインBcsC-Cについて，BC排出機構を解明するため，まず，上記１で精製した高純度のサンプルの多量体形成を分析する．その際に，ゲル濾過精製分析，Mass 分析，超遠心分析などをおこなう予定である．また，結晶構造解析ついては、引き続き,BcsC-Cの結晶化を行う．その際に,当研究室で開発していた核剤を使用する一般の結晶化方法とLCP法の両方を併用する予定である．結晶が得られたら,放射光施SPring-8とPFにて,回折データを測定する．構造解析に適用できる良質な結晶を得たら，位相計算には,AlphaFoldによって予測したモデルを用いて分子置換法とNative-SAD法を使用する予定である．
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